Desarrollo de ácido nucleico peptídico.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12482 (2023) Citar este artículo

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Se han desarrollado ampliamente numerosos métodos novedosos para detectar patógenos transmitidos por los alimentos para garantizar la seguridad alimentaria. Entre las bacterias importantes transmitidas por los alimentos, se identificó al Bacillus cereus como un patógeno preocupante que causa diversas enfermedades alimentarias, lo que generó interés en desarrollar métodos de detección eficaces para este patógeno. Aunque se dispone de un método estándar basado en cultivos y pruebas bioquímicas de confirmación, requiere mucho tiempo y trabajo. Se han desarrollado métodos alternativos basados en PCR, pero carecen de capacidad de alto rendimiento y facilidad de uso. Por lo tanto, este estudio intenta desarrollar un método sólido para la detección de B. cereus aprovechando los ácidos nucleicos peptídicos de pirrolidinilo (PNA) altamente específicos como sondas para un método de matriz de perlas con capacidad múltiple y de alto rendimiento. En este estudio, los PNA que portaban la columna vertebral del ácido prolil-2-aminociclopentanocarboxílico (ACPC) con secuencias de ARNr groEL, motB y 16S se acoplaron covalentemente con tres conjuntos de perlas con códigos de barras fluorescentes para detectar los tres genes de B. cereus. La matriz de cuentas desarrollada basada en acpcPNA mostró una buena selectividad donde solo las señales eran detectables en presencia de B. cereus, pero no para otras especies. Se encontró que la sensibilidad de este ensayo de perlas basado en acpcPNA para detectar ADN genómico era de 0,038, 0,183 y 0,179 ng para groEL, motB y 16S rRNA, respectivamente. Este rendimiento fue claramente superior al de su homólogo de ADN, lo que confirma una fuerza de unión mucho más fuerte del acpcPNA sobre el ADN. La solidez del método desarrollado se demostró aún más al probar leche enriquecida artificialmente y hojas de mostaza encurtidas con una interferencia mínima de las métricas de los alimentos. Por lo tanto, se ha demostrado que este método de matriz de perlas basado en acpcPNA de prueba de concepto sirve como un método alternativo eficaz basado en ácidos nucleicos para patógenos transmitidos por alimentos.

Bacillus cereus es uno de los principales patógenos transmitidos por los alimentos y se puede encontrar en una amplia gama de productos alimenticios, desde alimentos listos para el consumo, alimentos fermentados y productos lácteos1. Debido a su tolerancia al pH y la temperatura extremos, B. cereus se encontró comúnmente en varias etapas del procesamiento de alimentos2, lo que resultó en brotes graves de transmisión alimentaria en todo el mundo con una prevalencia general de hasta el 23,746%. En Europa, es la segunda causa de brote de transmisión alimentaria después del Staphylococcus aureus3. En EE.UU., alrededor de 63.000 personas al año enfermaron con una tasa de hospitalización del 0,4% por el grupo Bacillus4.

Los métodos rápidos y precisos que permitan el seguimiento y la detección oportunos de B. cereus en los alimentos pueden servir como método de mitigación clave para reducir sus brotes. Además, dado que no todas las especies de Bacillus son patógenas, es imperativo poder identificarlas al nivel de especies de Bacillus5. Si bien está disponible un método estándar ISO 7932:2004 basado en un protocolo de recuento en placa de agar6, este método requiere mucho tiempo y trabajo (requiere un período de incubación de hasta 24 h a 30 °C con 2 a 7 días adicionales para la confirmación). ensayo), y requiere profesionales capacitados. Se han desarrollado métodos moleculares alternativos, como técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para identificar B. cereus7,8. Sin embargo, la mayoría de estos métodos basados en PCR se basan en métodos de electroforesis en gel de baja resolución para visualizar los productos de PCR, lo que dificulta la interpretación de los resultados. Por lo tanto, se han desarrollado muchas técnicas avanzadas basadas en PCR, como la PCR cuantitativa (qPCR) y la PCR múltiple para superar estas limitaciones9,10,11, pero su capacidad múltiple aún es limitada debido a las complicaciones derivadas de la formación de dímeros de cebador12. Además, la mayoría de los métodos basados en PCR dependen del ADN como sonda específica, que puede ser degradada por factores ambientales, como la temperatura, el pH y las enzimas.

Para superar estas limitaciones, este estudio muestra un método de detección de B. cereus combinando las ventajas de la capacidad multiplex y la facilidad de adquisición de resultados de la técnica de matriz de perlas, y el ácido peptídico nucleico (PNA) altamente específico como sonda alternativa. La plataforma de matriz de cuentas utilizada en este estudio se basa en una tecnología xMAP multiplex, sensible y de alto rendimiento para diferentes tipos de objetivos13,14. Este método utiliza perlas paramagnéticas con códigos de barras fluorescentes funcionalizadas con grupos carboxilo para la unión covalente de ligandos nucleofílicos. Cada conjunto de cuentas puede identificarse mediante un láser rojo y la señal se mide desde un indicador fluorescente (R-ficoeritrina) mediante un láser verde13,15,16. En comparación con las técnicas tradicionales de microarrays de ADN, la tecnología de matriz de perlas ofrece varias ventajas. En primer lugar, el rendimiento de esta técnica es claramente mayor. Esto se debe a que se considera semiautomática, mientras que la tecnología de microarrays de ADN no lo es. En segundo lugar, debido a su paso de lavado automático, la tecnología de matriz de perlas generalmente presenta un fondo más bajo y una mayor consistencia que la tecnología de micromatriz de ADN17. Por último, el coste de un detector con tecnología de matriz de perlas es mucho más económico que el de la micromatriz de ADN, lo que lo hace más práctico. Como tal, se han aplicado con éxito varios sistemas de matriz de perlas basados en ADN para detectar una amplia variedad de contaminaciones alimentarias, como alérgenos alimentarios18, patógenos transmitidos por los alimentos en la carne de pollo19 y cuatro patógenos transmitidos por los alimentos, incluidos Salmonella Typhimurium, Brucella spp., B. cereus y Shigella. especies en productos lácteos20. Curiosamente, el método informado para la detección de B. cereus requirió una temperatura elevada a 38 °C para obtener una señal detectable, probablemente debido a una menor estabilidad en la unión ADN-ADN en comparación con la unión PNA-ADN. Esto lo hace poco práctico para el procesamiento industrial real20. Además, todos estos métodos de matriz de perlas utilizados utilizaron ADN como sonda específica, cuya especificidad depende significativamente de la temperatura de hibridación y la longitud de las sondas21. Supusimos que el uso de imitadores de ácidos nucleicos alternativos con mejor afinidad de unión al objetivo del ADN puede mejorar el rendimiento general de la detección.

En este sentido, se seleccionó el PNA, un imitador de ácido nucleico en el que la cadena principal de fosfodiéster ha sido reemplazada por una cadena principal de pseudopéptido, debido a sus diversas ventajas, como alta estabilidad térmica, alta especificidad de secuencia y alta sensibilidad para la discriminación de errores de coincidencia22,23,24. Combinado con la excelente estabilidad del PNA frente a nucleasas y proteasas, el PNA se ha desarrollado para muchas aplicaciones, incluida la detección de ácidos nucleicos25,26,27. Los tipos más nuevos de PNA, como los PNA conformacionalmente restringidos28, se desarrollaron con éxito para exhibir un rendimiento aún mejor que el PNA original (actualmente conocido como aegPNA). Por ejemplo, Vilaivan y sus colaboradores desarrollaron pirrolidinil PNA, que consiste en prolina modificada con nucleobases y β-aminoácidos cíclicos con anillos de cinco miembros (denominados acpcPNA)29,30. Esta característica molecular evita la degradación en condiciones básicas por ciclación intermolecular, un hecho que ocurre fácilmente con aegPNA que consiste en α-aminoácidos31. Además, acpcPNA tiene una estructura más rígida que aegPNA, lo que conduce a propiedades deseables como una mejor selectividad antiparalela, una mayor afinidad de unión y un mejor poder de discriminación hacia el desajuste de una sola base32. Como tal, acpcPNA se ha utilizado como sonda en estudios de detección de ADN que involucran diversas plataformas33,34,35,36,37, como sensores en papel, técnicas de resonancia de plasmones superficiales y técnicas electroquímicas.

Hasta donde sabemos, nunca antes se había combinado la plataforma de matriz de perlas Luminex con acpcPNA para la detección de patógenos transmitidos por alimentos. Solo hubo un estudio que empleó un concepto similar de combinar esta plataforma de matriz de perlas Luminex y aegPNA para mejorar la capacidad de detección del oncogén HER238. Se demostró que nuestro método desarrollado exhibe un buen rendimiento de detección con la solidez requerida para detectar B. cereus añadido a leche y lechuga encurtida como modelos para muestras de alimentos reales. Por lo tanto, el método desarrollado es muy prometedor para ser adoptado como plataforma práctica para la detección de B. cereus y el concepto puede aplicarse a otros patógenos en el futuro.

Las secuencias de las sondas acpcPNA utilizadas en este estudio se muestran en la Tabla 1. Las sondas de PNA se sintetizaron con el extremo N cubierto con acetilo y el extremo C modificado con una unidad de lisina para conjugar con los grupos carboxilo en las perlas paramagnéticas39.

Las secuencias de cebadores se diseñaron utilizando el software Primer3 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome) basado en la base de datos GenBank del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) como se muestra en la Tabla 1.

Las bacterias se obtuvieron del Centro de Investigación de Biorecursos de Tailandia, Tailandia (TBRC), la Colección Americana de Cultivos Tipo, Estados Unidos de América (ATCC) y el Departamento de Ciencias Médicas, Tailandia (DMST) (Tabla 2). Excepto Bacillus spp., todos se sembraron en una placa de agar 2xYT (16 g/L de triptona, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de cloruro de sodio y 15 g/L de agar) y se incubaron a 37 °C durante 16 –18 h. Se inoculó una sola colonia de bacterias en 10 ml de caldo 2xYT (16 g/l de triptona, 10 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de cloruro de sodio) y se incubó a 37 °C, 250 rpm durante 16 a 18 h. Bacilospp. se sembraron en placas de agar LB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de cloruro de sodio y 15 g/l de agar) y se incubaron a 30 °C durante 16 a 18 h. Una sola colonia de Bacillus spp. se inoculó en 10 ml de caldo LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 5 g/L de cloruro de sodio) y se cultivó a 30 °C, 250 rpm durante 16 a 18 h.

El ADN genómico de cada muestra bacteriana se extrajo utilizando un Minikit QIAamp®DNA (n.º 51304, Qiagen) de acuerdo con el manual del usuario. En resumen, se recogieron células bacterianas de una muestra de 1 ml mediante centrifugación a 7500 rpm durante 5 minutos. Los sedimentos se suspendieron en 180 µl de una solución enzimática (20 mg/ml de lisozima en Tris-HCl 20 mM, EDTA 2 mM y Triton-X 100 al 1,2%) y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Los sedimentos se trataron con 20 µl de proteinasa K a 56 °C durante 2 h antes de ser tratados con 4 µl de RNasa A (100 mg/ml) a temperatura ambiente durante 2 min. El ADN genómico se purificó adicionalmente mediante una minicolumna de centrifugación Qiagen eluyendo con 50 µl de agua estéril. La concentración y pureza del ADN genómico obtenido se determinaron mediante espectrofotometría UV (espectrofotómetro NanoDrop 8000, EE. UU.) a 260 y 280 nm.

Se utilizó ADN genómico (50 ng) como plantilla en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los amplicones diana utilizando cebadores biotinilados. Una solución de mezcla maestra de PCR incluía 1,25 U de ADN polimerasa Taq (#M0273S, Biolabs), 50 mM de KCl, una mezcla de tres conjuntos de cebadores marcados con biotina y 0,4 µM de dNTP (#N022, SibEnzyme). Se realizaron 35 ciclos de PCR usando (1) desnaturalización a 95 °C durante 30 s, (2) hibridación de cebadores a 52 °C durante 30 s y (3) extensión de ADN a 72 °C durante 1 min. Los productos de PCR biotinilados se analizaron mediante electroforesis en gel utilizando agarosa al 1,5 % p/v (n.º 2125, OmniPur) en tampón TBE 0,5 × (Tris 44,5 mM, ácido bórico 44,5 mM y EDTA 1 mM) y SYBR®Safe. Las imágenes de los geles de agarosa se tomaron bajo luz ultravioleta (302 nm), con identificación del tamaño mediante un marcador de escalera de ADN (100 pares de bases, M25, SibEnzyme).

Se acoplaron tres conjuntos de perlas con códigos de barras fluorescentes (#MC10012, #MC10015, #MC10021, Luminex) con tres acpcPNA específicos de los genes groEL, motB y 16S rRNA. Cada región de cuentas (5 x 106 cuentas/región) se resuspendió en 20 µl de MES 0,1 M, pH 4,5 (#M5057, Sigma) y se unió con un acpcPNA específico (0,1 nmol) y 2,5 µl de 1-etil 10 mg/ml. Clorhidrato de -3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, (EDC·HCl, Thermo Fisher Scientific) durante 30 min (en la oscuridad). Después de este período, se añadió a la reacción el segundo lote de EDC·HCl (2,5 µL de 10 mg/mL) y se incubó durante otros 30 min. Las perlas cargadas con PNA se lavaron con una solución de Tween-20 al 0,02 % (BioBasic inc.) y SDS al 0,1 % (BioBasic inc.) antes de reconstituirlas en 20 µl de tampón TE pH 8,0 (Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM). y se mantuvo a 4°C en la oscuridad hasta su uso.

Se mezclaron tres regiones de perlas acpcPNA (2500 perlas/región/reacción, 33 µl cada una) en TMAC 1,5 × (TMAC 4,5 M, solución de Sarkosyl al 0,15 %, Tris-HCl 75 mM y EDTA 6 mM, pH 8,0) y se transfirieron. a una placa de 96 pocillos no vinculantes (#655901, Greiner Bio-One). El producto de PCR biotinilado (10 µl) se añadió al tampón TE (7 µl), se calentó a 95 °C durante 10 minutos y se colocó en hielo rápidamente durante 3 minutos para mantener el ADN en forma monocatenaria. Para el paso de hibridación, la solución del producto de PCR desnaturalizado se añadió a la mezcla de perlas en la placa de 96 pocillos sin unión y se incubó a 25 °C con agitación durante 1 h antes de eliminar cualquier producto de PCR no unido lavando tres veces con 100 µL de 1 × tampón TMAC (TMAC 3 M, solución de Sarkosyl al 0,1 %, Tris-HCl 50 mM y EDTA 4 mM, pH 8,0) con la ayuda de una placa separadora magnética. Se añadió estreptavidina marcada con R-ficoeritrina (25 µl de 10 µg/ml de SAPE, n.° S866, Life technology™, EE. UU.) en 1 x tampón TMAC a la placa y se incubó en una incubadora con agitador de microplacas (Hercuvan Lab Systems, EE. UU.). ) a 25 °C durante 15 min. La placa se lavó con 100 µl de tampón TMAC 1 × tres veces para eliminar la estreptavidina no unida antes de resuspenderse en 75 µl de líquido MAGPIX Drive (#40-50030, Luminex). Se utilizó un láser verde en un instrumento Luminex (MAGPIX™, Luminex, EE. UU.) para medir la señal de las moléculas informadoras a 525 nm. Se utilizó láser rojo para identificar un conjunto de perlas específico a 635 nm. Las señales de fluorescencia de SAPE se midieron y reportaron como intensidad fluorescente media (MFI), que se consideraría como un resultado positivo cuando su valor fuera al menos 2 veces mayor que el fondo o el control negativo (agua destilada como plantilla en la amplificación por PCR). .

Para evaluar la especificidad del método desarrollado, se utilizó ADN genómico (50 ng) de seis patógenos transmitidos por alimentos no objetivo (B. subtilis, E. coli, E. coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium). plantillas en las reacciones de PCR. Los productos de la PCR se analizaron con la misma matriz de perlas de PNA utilizando el mismo protocolo que B. cereus descrito anteriormente (cinco réplicas).

Para determinar la sensibilidad, se utilizaron diferentes concentraciones de ADN genómico (0,002–200 ng) de B. cereus como plantillas en las reacciones de PCR y se analizaron con la matriz de cuentas (diez réplicas).

Los valores del límite de detección (LOD) se calcularon como la concentración de ADN genómico con una señal superior a 2 veces la del fondo o el control negativo (agua destilada como plantilla en la amplificación por PCR). La señal de intensidad fluorescente media (MFI) se ajustó a la siguiente ecuación de curva dosis-respuesta.

Y es una intensidad fluorescente del RPE cuando se detecta ADN genómico de concentración de patógeno X. mientras que A, B y C son constantes del ajuste de la curva.

Se acoplaron tres sondas de ADN específicas (0,1 nmol) con un espaciador de hexilo con secuencias equivalentes a las de acpcPNA con tres regiones de perlas (#MC10026, #MC10061, #MC10027, Luminex) mediante acoplamiento de carbodiimida como se describe en la sección sobre conjugación de perlas con acpcPNA. . Posteriormente, se probó la sensibilidad de las perlas acopladas a ADN para detectar diferentes concentraciones de ADN genómico como se describe en la sección de sensibilidad.

Para validar el método desarrollado, se probaron muestras de alimentos enriquecidas artificialmente. Se recolectaron dos tipos de muestras de alimentos (leche y hojas de mostaza encurtidas) de los supermercados locales (12 muestras por tipo de muestra). Las muestras se analizaron para detectar la ausencia de B. cereus mediante el método de la Organización Internacional de Normalización 7932 (ISO 7932) antes del experimento de adición. Cada muestra de alimento libre de B. cereus (25 g) se homogeneizó con 225 ml de caldo LB en bolsas de licuadora estériles (#AES400/50G) durante 2 minutos y se añadió B. cereus (10 UFC/mL en caldo LB) seguido de incubación a 30 ° C durante 16 a 18 h con agitación de 250 rpm. El ADN genómico se extrajo de las muestras de alimentos enriquecidos mediante un QIAamp®DNA Minikit como se describe en la sección de extracción de ADN genómico. El ADN extraído (2 µl) se usó como plantilla para la amplificación por PCR y se analizó mediante la matriz de perlas como se describió anteriormente (tres réplicas).

Para distinguir B. cereus de otras especies del grupo Bacillus (B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides y B. weihenstephanensis), se han seleccionado previamente los genes chaperona groEL y motB de movilidad como biomarcadores robustos mediante método bioinformático debido a sus secuencias únicas en B. cereus entre otros miembros del género37. Para el control interno, se selecciona el gen esencial 16S rRNA debido a su secuencia altamente conservada entre las bacterias40. De hecho, anteriormente hemos logrado utilizar acpcPNA de estos genes como sonda específica y control interno en el desarrollo de un sensor en papel altamente específico y sensible para detectar B. cereus37. Es importante destacar que, si bien la plataforma basada en papel es teóricamente capaz de realizar análisis multiplex, el desarrollo de un dispositivo sensor basado en papel con más de tres objetivos genéticos es generalmente muy complicado. Por otro lado, se pueden incluir un total de 50 objetivos genéticos en un solo pozo de ensayo utilizando tecnología de matriz de perlas, gracias a su naturaleza semiautomática. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo desarrollar una tecnología de matriz de perlas basada en acpcPNA de prueba de concepto para potenciar la capacidad múltiple y de alto rendimiento de la plataforma de matriz de perlas para la detección de patógenos transmitidos por alimentos con una especificidad superior. Se vincularon tres regiones de perlas con códigos de barras fluorescentes con sondas acpcPNA cuyas secuencias coinciden con groEL, motB y 16S rRNA mediante el acoplamiento entre el grupo carboxilo de la perla y el grupo amino en el extremo N del PNA41 (Fig. 1A). A continuación, las sondas acpcPNA inmovilizadas con perlas se hibridaron con los amplicones biotinilados obtenidos de la PCR múltiple mediante un fuerte emparejamiento de bases de Watson y Crick (Fig. 1B, C). A esto le siguió el marcaje del ADN biotinilado capturado con perlas mediante una estreptavidina marcada con R-ficoeritrina y las intensidades de fluorescencia se midieron mediante láseres duales (Fig. 1D, E).

Esquema del método de matriz de cuentas basado en acpcPNA. (A) Un grupo carboxilo en cada perla paramagnética con código de barras fluorescente permite la conjugación covalente con el grupo amino en la molécula acpcPNA. (B) Se utilizaron tres conjuntos de cuentas acoplados con tres acpcPNA específicos para los genes groEL, motB y 16S rRNA para detectar productos de PCR biotinilados a partir de un método de PCR múltiple. (C) El ADN monocatenario biotinilado después de desnaturalizado a 95 °C se hibridó con perlas basadas en acpcPNA. (D) Se unieron moléculas de estreptavidina marcadas con R-ficoeritrina (SAPE) a la etiqueta de biotina en el complejo de perlas de ADN-PNA. (E) Se utilizó un láser verde para detectar la señal fluorescente de SAPE y un láser rojo para identificar la región del conjunto de cuentas.

Para evaluar la eficiencia de unión de las secuencias de acpcPNA sintetizadas a sus correspondientes ADN complementarios, cada tipo de perla de acpcPNA (groEL, motB y rRNA 16S) se hibridó por separado con sus secuencias de ADN complementarias (Fig. S1). El resultado indicó que los acpcPNA pudieron unirse específicamente a sus ADN complementarios en todos los casos. Este resultado exitoso puede atribuirse a la naturaleza conformacionalmente restrictiva del PNA y a la falta de cargas negativas en la columna vertebral, las cuales contribuyeron a la fuerte afinidad de unión32. Además, la combinación de las tres perlas y su ADN complementario todavía mostraba señales de fluorescencia claras, aunque con intensidades ligeramente disminuidas. Este hallazgo confirmó que este sistema de detección tiene potencial para estudios más complejos.

A partir de entonces, se realizó una serie de optimizaciones para obtener el mejor rendimiento posible en los experimentos de hibridación con amplicones, que son mucho más grandes que las cadenas de ADN complementarias. Los parámetros clave que se optimizaron incluyeron el tiempo de hibridación, las concentraciones de la molécula indicadora (estreptavidina marcada con R-ficoeritrina) y las concentraciones de cebadores. Se ensayó un intervalo de tiempos de hibridación de 15 a 60 min. Como se muestra en la Fig. S2, la hibridación de 30 minutos proporcionó la relación señal-fondo más alta para el gen groEL, mientras que la hibridación de 60 minutos fue la mejor para los genes de ARNr motB y 16S. Por tanto, se eligió un tiempo de hibridación de 60 min. Además, la Fig. S3 sugirió que 10 µg/mL de la molécula indicadora dieron los mejores resultados, donde las relaciones señal-fondo fueron de 8,41, 4,06 y 2,44 para los genes groEL, motB y 16S rRNA, respectivamente. Por último, dado que pueden surgir complicaciones con la PCR múltiple, las concentraciones de cebadores también son un factor clave que debe optimizarse. Esto se hizo centrándose primero en el cebador del gen de control (ARNr 16S), ya que probablemente domina la amplificación debido a su gran abundancia en la plantilla de ADN genómico. El experimento preliminar sugirió que 50 nM es la concentración más pequeña del cebador de ARNr 16S que aún puede proporcionar una señal apreciable. Además, otro experimento separado estableció que la proporción de cantidad 1:2 de cebadores groEL:motB proporcionó la mayor intensidad de señal para la amplificación simultánea usando estos dos genes. A partir de entonces, reunimos estos datos preliminares en la optimización final para la PCR múltiple como se muestra en la Fig. S4, donde tanto la concentración del cebador de ARNr 16S (a 50 nM) como la proporción de cantidad de los cebadores groEL y motB (1: 2) se mantuvieron constantes. Es decir, sólo se variaron las concentraciones de los cebadores groEL y motB. Los resultados sugirieron que, excluyendo las concentraciones más bajas probadas, otras condiciones no dieron resultados significativamente diferentes. Por lo tanto, la segunda concentración más baja de cebadores parecía ser la opción más lógica. Sin embargo, esta condición (300:600:50 nM de cebadores de ARNr groEL, motB y 16S, respectivamente) no pudo dar lugar a amplificaciones apreciables en otras especies bacterianas analizadas. Por lo tanto, las concentraciones de 400:800:50 nM de cebadores de ARNr groEL, motB y 16S, respectivamente, se seleccionaron para estudios posteriores.

La especificidad del método desarrollado se evaluó frente a siete especies relevantes transmitidas por los alimentos, a saber, B. cereus, B. subtilis, Escherichia coli, E. coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium. En cada caso, el ADN genómico aislado se utilizó como plantilla para la amplificación por PCR múltiple con etiquetado de biotina en los tres genes diana y se analizó mediante la matriz de perlas basada en acpcPNA. En el caso de la detección de B. cereus, tanto las perlas groEL como las motB mostraron resultados positivos con la señal más alta de la perla groEL en aproximadamente 7 veces la relación señal-fondo (Fig. 2). Las señales de las perlas groEL y motB para otras bacterias analizadas fueron negativas, mientras que el control positivo interno de las perlas de ARNr 16S fue positivo en todas las especies de bacterias, lo que confirma que este gen se puede emplear como un control interno sólido para esta plataforma de detección.

Especificidad de la detección de matriz de perlas basada en acpcPNA contra B. cereus, B. subtilis, E. coli, E. coli O157:H7, S. aureus, Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium. Se analizó una muestra de ADN genómico (50 ng) de cada especie. Cada grupo de datos se representó como un promedio de cinco réplicas con una barra de error que indicaba una desviación estándar. La línea de puntos representa un valor de corte que es dos veces la intensidad del control negativo. El control negativo tenía agua como plantilla para la amplificación.

En general, si bien las señales obtenidas de la detección de amplicones de ADN más largos (200–310 pb) fueron más bajas que las obtenidas de oligonucleótidos de ADN sintéticos cortos (Fig. S1), los resultados son suficientes para una identificación inequívoca de B. cereus. Esta disminución en la intensidad de la señal no es sorprendente porque los amplicones utilizados en este documento tienen entre 200 y 310 pb, que son mucho más largos que las secuencias de sonda en el soporte sólido (12 a 15 pb). Dada la posibilidad de formar estructuras secundarias a partir de ADN de esta longitud16,42, los resultados se consideran decentes. Además, la señal más baja podría deberse a la complicación de los amplicones de PCR múltiples. El mayor número de conjuntos de cebadores para múltiples objetivos dentro de una sola reacción podría generar productos de amplificación espurios debido a la formación del dímero del cebador43.

El límite de detección (LOD) de este método se evaluó para todos los genes utilizados en la detección de concentraciones conocidas de ADN genómico (Fig. 3A). Se mostró un claro aumento de las intensidades fluorescentes alrededor de 0,1 ng, donde la señal comenzó a aumentar de forma lineal hasta aproximadamente 1 ng antes de alcanzar una meseta16. La perla groEL PNA pudo detectar tan solo 0,038 ng de ADN genómico, mientras que las perlas motB y 16S rRNA dieron valores LOD de 0,183 y 0,179 ng de ADN genómico, respectivamente. Los valores LOD obtenidos son menos sensibles que nuestro sensor de papel anterior37, lo que podría deberse al uso de PCR múltiple, que se sabe que es más complicado de desarrollar y, a menudo, menos sensible que la PCR convencional44. Sin embargo, la capacidad múltiple de este método desarrollado y la facilidad de una PCR múltiple de un solo paso ofrecen un avance importante del método de detección, ya que puede incluir además la detección de otros genes importantes, como los genes de la toxina emética de cepas de B. cereus42 y genes específicos para otras bacterias. Es importante destacar que el rendimiento superior de acpcPNA sobre el ADN también se demostró al evaluar el rendimiento de detección de sondas de ADN que tienen las mismas secuencias que las sondas acpcPNA utilizadas en este estudio (Fig. 3B). Curiosamente, mientras que el LOD de la perla de ADN groEL era comparable a su contraparte acpcPNA (0,032 ng frente a 0,038 ng respectivamente), la señal de la perla de ADN groEL parecía alcanzar una meseta algo más alta, es decir, una relación señal-fondo más alta, a niveles mucho más altos. mayor cantidad de muestra de ADN genómico (~ 30 ng) que la perla acpcPNA. No obstante, las perlas de ADN de ARNr motB y 16S no pudieron detectar ADN genómico en ninguna cantidad de ADN genómico analizado (Fig. 3B). Esto podría explicarse por la baja estabilidad de los dúplex formados entre las sondas de ADN relativamente cortas y el ADN diana. Los resultados confirman el rendimiento superior de acpcPNA sobre las sondas de ADN en términos de robustez en el ensayo multiplex.

Respuestas de (A) matrices basadas en acpcPNA (LOD = 0,038 ng (a), 0,183 ng (b) y 0,179 ng (c) de ADN genómico para cuentas de PNA de ARNr groEL, motB y 16S, respectivamente), y (B ) matrices de perlas basadas en ADN (LOD = 0,032 ng (a) para perlas de ADN groEL). Cada punto de datos se representó como un promedio de diez réplicas con una barra de error que indicaba una desviación estándar. La línea de puntos en la parte inferior del gráfico representa un valor de corte que es dos veces la intensidad del control negativo.

Se han notificado brotes de B. cereus en diversos alimentos, como alimentos ricos en almidón y arroz, verduras crudas y procesadas, pan, leche y productos lácteos, productos cárnicos y alimentos listos para el consumo2,3. Para validar el método desarrollado, se seleccionaron dos tipos de matrices alimentarias, a saber, leche y hojas de mostaza encurtidas, para representar los productos lácteos y los alimentos listos para el consumo. Se confirmó que las muestras de alimentos estaban libres de B. cereus mediante el método ISO 7932 antes de los experimentos de adición. A la leche sin B. cereus y a las hojas de mostaza encurtidas (n = 12 por cada matriz alimenticia) se les añadió 10 UFC/g de B. cereus. Esta cifra es inferior al número máximo aceptable de B. cereus (102 UFC/mL y 50 UFC/g para niños menores de 6 meses) según la Comisión del Codex Alimentarius de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO). ) y la Organización Mundial de la Salud (OMS)45. Posteriormente, las muestras enriquecidas se enriquecieron mediante incubación a 30 °C durante la noche, seguida de extracción de ADN genómico. Los productos de PCR biotinilados se prepararon mediante PCR múltiple en las condiciones óptimas obtenidas anteriormente, y las cantidades de la secuencia diana de ADN para los tres genes se midieron mediante la matriz de perlas basada en acpcPNA. Como control positivo se utilizó el medio de cultivo con 10 UFC/g de B. cereus. Hubo tres tipos de controles negativos en este estudio para cubrir todas las posibilidades, incluido el uso de agua destilada como plantilla para la amplificación por PCR y el uso de matrices sin aditivos para la purificación del ADN antes de la amplificación por PCR. Afortunadamente, el ensayo desarrollado pudo identificar tres genes específicos de B. cereus con poca interferencia de la matriz alimentaria (Fig. 4). La perla groEL volvió a proporcionar la señal más alta en ambas matrices. Las señales más bajas obtenidas de las hojas de mostaza encurtidas probablemente se deban a la presencia de varios inhibidores, como enzimas, polisacáridos, proteínas y sal, todos los cuales podrían interferir con la extracción del ADN genómico y la posterior amplificación por PCR9. Sin embargo, los datos de matrices de alimentos reales demostraron claramente que la matriz de perlas desarrollada basada en acpcPNA puede adoptarse como un método alternativo para la detección específica y múltiple de patógenos transmitidos por los alimentos.

La matriz de cuentas basada en acpcPNA se utiliza para detectar B. cereus en muestras de alimentos enriquecidas artificialmente. Se añadió B. cereus (10 UFC/ml) a la leche, hojas de mostaza encurtidas y control positivo (medio de cultivo). Cada grupo de datos se representó como un promedio de 12 muestras con una barra de error que indicaba una desviación estándar. La línea de puntos representa un valor de corte que es dos veces la intensidad del control negativo (agua como plantilla en la amplificación por PCR).

En este estudio, desarrollamos con éxito una técnica de matriz de perlas basada en acpcPNA multiplex para identificar Bacillus cereus con buena especificidad, límite de detección bajo y capacidad de alto rendimiento. El tiempo total de ensayo de 4 h, incluida la amplificación por PCR múltiple, es más corto que el método ISO basado en cultivo que requiere al menos 72 h para identificar B. cereus. La validación del método desarrollado con matrices de alimentos reales representativas indica que nuestro método puede detectar con precisión el patógeno prevalente B. cereus y su viabilidad se puede explorar más a fondo para respaldar la seguridad alimentaria en procesos industriales.

Los conjuntos de datos analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio de GenBank, [groEL Gene ID: 72447092; ID del gen motB: 72451176; ID de nucleótido de ARNr 16S: NR_074540.1].

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Los autores agradecen al Centro Nacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (BIOTEC) y la Universidad de Chulalongkorn: beca de doctorado NSTDA, la beca del 90 aniversario de la Universidad de Chulalongkorn y la beca de experiencia de investigación en el extranjero para estudiantes de posgrado por su apoyo financiero. Esta investigación también recibió apoyo financiero de NRSF a través de la Unidad de Gestión de Programas para Recursos Humanos y Desarrollo Institucional, Investigación e Innovación (número de subvención PMU-B: B16F640114).

Centro Nacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (BIOTEC), Agencia Nacional de Desarrollo de Ciencia y Tecnología (NSTDA), Khlong Luang, Pathum Thani, Tailandia, 12120

Prae Noppakuadrittidej, Ratthaphol Charlermroj, Manlika Makornwattana, Sudtida Kaew-amdee y Nitsara Karoonuthaisiri

Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Chulalongkorn, Phayathai Rd., Pathumwan, Bangkok, Tailandia, 10330

Prae Noppakuadrittidej, Tirayut Vilaivan y Thanit Praneenararat

Programa de Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad Chulalongkorn, Phayathai Rd., Pathumwan, Bangkok, Tailandia, 10330

Antes de Noppakuadrittidej

Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Chulalongkorn, Phayathai Rd., Pathumwan, Bangkok, Tailandia, 10330

Rungaroon Waditee-Sirisattha

Unidad de Investigación de Síntesis Orgánica, Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Chulalongkorn, Phayathai Rd., Pathumwan, Bangkok, Tailandia, 10330

Tirayut Vilaivan

Centro Internacional Conjunto de Investigación sobre Seguridad Alimentaria, Khlong Luang, Pathum Thani, Tailandia, 12121

Thanit Praneenararat y Nitsara Karoonuthaisiri

Instituto para la Seguridad Alimentaria Global, Queen's University Belfast, Belfast, Reino Unido

Karoonuthaisiri juzgado

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PN realizó todos los experimentos de laboratorio en este estudio. RC ayudó en algunos experimentos y dio consejos sobre varios aspectos del estudio. MM brindó apoyo en experimentos de PCR y análisis bioinformáticos. SK brindó apoyo en experimentos con conjuntos de cuentas. RW brindó apoyo en el análisis bioinformático. TV brindó apoyo en química PNA. TP y NK escribieron el manuscrito y supervisaron todas las actividades de investigación.

Correspondencia a Thanit Praneenararat o Nitsara Karoonuthaisiri.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Noppakuadrittidej, P., Charlermroj, R., Makornwattana, M. et al. Desarrollo de tecnología de matriz de perlas basada en ácido nucleico peptídico para la detección de Bacillus cereus. Representante científico 13, 12482 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38877-1

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Recibido: 26 de abril de 2023

Aceptado: 17 de julio de 2023

Publicado: 01 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38877-1

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