Efectos de los reguladores del crecimiento vegetal y la sacarosa sobre la proliferación y calidad del tejido embriogénico en Picea pungens

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13194 (2023) Citar este artículo

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El tejido embriogénico (TE) es importante para la modificación genética y la regeneración de plantas. La capacidad de proliferación y el vigor de la ET son cruciales para la propagación de plantas mediante embriogénesis somática. En este estudio, se indujo ET a partir de embriones cigóticos maduros en abeto azul (Picea pungens Engelm.). Hubo diferencias significativas en la inducción de ET entre dos procedencias, es decir, 78,8 ± 12,5% y 62,50 ± 12,8% respectivamente. Se investigaron más a fondo los efectos del ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 6-bencilaminopurina (6-BA) y/o sacarosa sobre la proliferación de ET y la maduración de embriones somáticos (SE) con cuatro líneas celulares. La tasa de proliferación de ET más alta alcanzó 1473,7 ± 556,0% quincenal. Las concentraciones de 2,4-D o 6-BA aplicadas en la etapa de proliferación tisular afectaron la maduración SE entre las líneas celulares, mientras que la sacarosa mostró menos efectos. La tasa más alta, 408 ± 230 SE maduros/g FW, se logró en cultivos de maduración de SE. Esta investigación demostró que las condiciones de cultivo, es decir, las concentraciones específicas de 2,4-D y BA, en la etapa de proliferación de ET afectaron no sólo el crecimiento de ET, sino también la calidad de la ET para la maduración de SE. Este estudio reveló la necesidad y el beneficio de desarrollar protocolos generales y específicos de genotipo para la producción eficiente de SE maduras o plantas somáticas en abeto azul.

Las agujas de abeto azul (Picea pungens Engelm.) son de color azul plateado durante todo el año, lo que tiene un gran valor ornamental para el paisajismo1. En la actualidad, la pícea azul se regenera generalmente mediante la germinación de semillas en China2,3. Debido al alto precio de las semillas y plántulas, el número de variedades élite introducidas es limitado4. Las acículas de la progenie pueden ser diferentes en color, forma, estructura y velocidad de crecimiento, por lo que la calidad de las plántulas es limitada. La tecnología de embriogénesis somática se puede utilizar para producir una gran cantidad de plantas somáticas con rasgos genéticos consistentes en un período de tiempo relativamente corto5, lo que por lo tanto es poderosa en la propagación a gran escala de genotipos de élite en abeto azul.

En la actualidad, muchas especies de árboles podrían propagarse mediante embriogénesis somática. El primer éxito de la embriogénesis somática en especies de coníferas se remonta a 1985, cuando Hakman et al.6 utilizaron embriones cigóticos inmaduros de picea común (Picea abies) para inducir tejido embriogénico (TE) y luego obtuvieron embriones somáticos maduros (SE). Desde 2000 se han publicado varios artículos sobre la optimización de la embriogénesis somática en especies de coníferas, entre ellos: Pinus radiata7, Picea abies8, Picea glauca9, Larix hybrids10, pino coreano11,12,13,14, Abies nebrodensis15, Abies nordmanniana16, Abies alba17 y abeto azul1. . La proliferación de ET junto con la maduración de SE son pasos clave para la propagación a gran escala y la preservación a largo plazo del germoplasma de coníferas15. Nielsen et al.16 informaron fuertes efectos clonales en la mayoría de los rasgos durante el proceso de propagación a través de SE en Abies nordmanniana16. La grave dependencia de la línea celular entre la proliferación de ET y la maduración de SE también se informó en Abies alba17. Este tipo de investigación no se había informado anteriormente en el abeto azul.

Ha habido pocos informes de investigación sobre el inicio de la embriogénesis somática en el abeto azul. Afele et al.18 utilizaron embriones maduros de abeto azul, como explantes, para la inducción de ET. La tasa de inducción de ET más alta fue del 16% y el número de embriones somáticos (SE) producidos fue de solo 9,7 SE/g FW. Sun et al.4 optimizaron aún más el sistema de inducción ET. Lograron una tasa de inducción de hasta el 45,5%. Sin embargo, en las siguientes etapas, hubo muchos embriones anormales que dieron como resultado una capacidad de germinación SE deficiente. Hazubska-Przyby et al.19 indujeron ET a partir de embriones cigóticos con la tasa de inducción más alta del 23,75%, mientras que no se obtuvieron EE maduros. Tao et al.1, desarrollaron por primera vez un sistema técnico completo de embriogénesis somática en abeto azul, incluidos los cultivos de inducción y proliferación de ET, maduración de SE, germinación y conversión de SE, así como la dureza de las plantas somáticas. Sin embargo, el sistema técnico de embriogénesis somática en el abeto azul necesita una mayor optimización para resolver problemas, como las bajas tasas de inducción y proliferación de ET, así como la escasa capacidad de maduración de SE. Todos estos factores limitaron el proceso de propagación a gran escala mediante embriogénesis somática en el abeto azul. La esencia de la proliferación de ET es la división celular de la masa proembriogénica. Factores como el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), la 6-bencilaminopurina (6-BA) y la sacarosa mostraron grandes influencias en la proliferación de ET20, al igual que las condiciones de cultivo en la etapa de proliferación de ET. Sin embargo, hubo pocos estudios sobre sus efectos sobre la maduración del SE a partir de entonces. Hay varios factores que influyen en la maduración del SE21,22. Es esencial estudiar el efecto de las condiciones de cultivo en la etapa de proliferación ET sobre la maduración SE para optimizar todo el sistema de cultivo para la propagación masiva. En este estudio, se utilizaron embriones cigóticos maduros de abeto azul de dos procedencias como explantes para inducir la ET, y las ET inducidas se utilizaron como materiales experimentales para explorar los efectos del 2,4-D, 6-BA y/o sacarosa en la ET. tasas de proliferación y la calidad de ET en la maduración SE con el fin de optimizar el sistema SE para la producción eficiente de plantas somáticas de élite en abeto azul.

Las semillas maduras de abeto azul de dos procedencias se etiquetaron como F1 y F2 y se almacenaron en un congelador a -40 ℃ antes de su uso. Las semillas se compraron en Carson Forest (procedencia F1), NM, EE. UU. en 2010, o San Isabel (procedencia F2), CO, EE. UU. en 2008. Las semillas eran de diferentes genotipos, que fueron producidas por varios árboles madre mediante polinización abierta. . Las semillas para la prueba se enjuagaron con agua corriente del grifo durante 18 h y luego se colocaron en una mesa de trabajo ultralimpia y se esterilizaron con alcohol al 75 % durante 30 s. Luego, las semillas se enjuagaron con agua destilada estéril de 3 a 5 veces y se esterilizaron con una solución de NaClO (cloro al 4%) durante 15 minutos, antes de enjuagarse de 3 a 5 veces con agua esterilizada. La cubierta de la semilla y los megagametofitos se eliminaron con un bisturí. Los embriones fueron extraídos y utilizados como explantes. Los embriones disecados se colocaron horizontalmente sobre la superficie del medio de cultivo. El medio de inducción de ET fue el medio LV modificado (mLV)23,24 suplementado con 4,0 mg/L de 2,4-D, 1,0 mg/L de 6-BA, 10 g/L de sacarosa, 0,8 g/L de caseína hidrolizada con ácido (Caseína hidrolizado, CH), 0,5 g/l de l-glutamina y 4 g/l de gedrita.

Dos meses después de ser cultivada con el medio de proliferación, la ET inducida se utilizó para los experimentos de proliferación de ET y maduración de SE. Se reemplazó un medio nuevo cada dos semanas y se utilizaron cuatro líneas celulares seleccionadas, incluidas las líneas celulares 2#04, 2#13, 1#16 y 2#02. Entre ellas, la línea celular 1#16 se indujo a partir de una fuente F1, mientras que las líneas celulares 2#04, 2#13 y 2#02 se indujeron a partir de una fuente F2. Se seleccionó la ET de morfología filamentosa transparente para los subcultivos con el fin de obtener la mayor cantidad de ET posible para pruebas posteriores. Para la proliferación de ET se utilizó el medio mLV, que se complementó con 1,0 mg/l de 6-BA y 2,0 mg/l de 2,4-D. Otras condiciones de cultivo fueron las mismas que las descritas en la Sección "Inducción ET".

Para el experimento de la prueba 2,4-D, se utilizó medio de cultivo de mLV como medio basal. Se complementó con 0, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 o 6,0 mg/L de 2,4-D, 1,0 mg/L de 6-BA. Las otras condiciones de cultivo fueron las mismas que las descritas en 2.1. Se utilizaron cinco placas de Petri, como mínimo, para la recolección de datos para cada tratamiento y cada línea celular. El experimento se repitió cuando fue necesario. La ET inicial para la inoculación fue de 0,2 g por caja de Petri. Después de 14 días, se pesó el peso fresco (g) de ET en cada plato para calcular la tasa de proliferación de ET según la siguiente fórmula.

Para este experimento se utilizaron las mismas cuatro líneas celulares. En el medio mLV basal, se agregaron 0, 0,5, 1,0, 2,0 o 3,0 mg/l de 6-BA respectivamente con 2,0 mg/l de 2,4-D. Otras condiciones de cultivo fueron las mismas que las descritas en la Sección "Inducción ET". Se utilizaron cinco cajas de Petri para cada tratamiento con cada línea celular.

Se utilizaron las mismas líneas celulares para el experimento. En el medio basal, se agregaron 5, 10, 20 o 30 g/l de sacarosa, respectivamente, con 2,0 mg/l de 2,4-D y 2,0 mg/l de 6-BA. Otras condiciones de cultivo fueron las mismas que las de la Sección "Inducción ET". Se utilizaron cinco cajas de Petri para cada tratamiento con cada línea celular.

En cultivos de proliferación, la ET de las mismas cuatro líneas celulares se trató con base en lo descrito en las Secciones “Experimentos con las diferentes concentraciones de reguladores del crecimiento vegetal” y “Experimento con diferentes concentraciones de sacarosa”. La ET después de los tratamientos de 7 a 10 días en cultivos de proliferación se utilizó para la maduración SE con el fin de determinar la calidad de la ET. Se agregaron aproximadamente 80 mg de ET a 4 ml de medio líquido, que era el medio de proliferación sin reguladores del crecimiento de las plantas ni agente solidificante. El tejido se mezcló bien con el medio de cultivo. Después de filtrar la mezcla, el papel de filtro con ET se colocó sobre medio de maduración SE en una placa de Petri de 10 cm de diámetro. Para la diferenciación y maduración de SE, el medio basal (mLV) se complementó con 13,22 mg/L de ácido abscísico (ABA), 30 g/L de sacarosa, 6 g/L de gelrita, 0,8 g/L de CH, 0,5 g/L de l-glutamina. y 2 g/L de carbón activado (AC). Se utilizaron cinco cajas de Petri para cada tratamiento con cada línea celular. El cultivo se mantuvo en la oscuridad a 23 ± 2 °C y el número de SE se contó después de un cultivo de maduración de SE de 60 días. Los embriones somáticos con cotiledones bien desarrollados se contaron como SE maduros.

Se recolectaron tejidos vegetales en varias etapas de cultivo, incluido el tejido del cultivo de proliferación ET durante 7 a 10 días (SE inmaduros tempranos); tejidos en cultivo de maduración SE durante 5 días (etapa I), 10 días (etapa II), 30 días (etapa III), 45 días (etapa IV) y 60 días (etapa V). Los materiales vegetales (0,1 g ET) en cada etapa se tiñeron con una solución de safranina al 0,1% durante 10 minutos y se colocaron en un portaobjetos de vidrio, se les goteó una gota de agua y se cubrieron con un cubreobjetos. La ET se distribuyó uniformemente golpeando ligeramente con el extremo plano de un lápiz, se observó inmediatamente y se fotografió con un microscopio (OLYMPUS CX 31, Japón; equipado con una cámara Canon DS126271, Japón).

Los cálculos se realizaron utilizando Excel 2003 (Microsoft, Estados Unidos). El análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y las pruebas de comparaciones múltiples de Duncan se realizaron utilizando SPSS 19 (IBM, Estados Unidos). Los gráficos se construyeron con Sigma Plot 12.0 (Systat, Estados Unidos).

Los autores declaran que el estudio de las plantas en esta investigación, incluida la recolección de materiales vegetales, cumple con las directrices y legislación institucionales, nacionales e internacionales pertinentes.

Después de ser colocados en medio de inducción ET durante 7 días, los embriones cigóticos, como explantes, se expandieron y los cotiledones se agrandaron (Fig. 1a). Se indujeron callos no embrionarios (ECN) y ET bajo los tratamientos suministrados con 2,4-D de diferentes concentraciones. La superficie de NEC era dura, de color amarillo verdoso y granulada (Fig. 1b), mientras que ET aparecía como filamentos blancos y esponjosos (Fig. 1c). La tasa de inducción de ET alcanzada fue de 62,50 ± 12,8 % o 78,8 ± 12,5 % con procedencia L1 o procedencia L2 respectivamente.

El proceso de inducción de ET en abeto azul. (a) un embrión cigótico en medio de inducción ET durante 7 días; (b) Callo no embriogénico en cultivo de inducción durante 60 días; (c) Tejido embriogénico en cultivo de inducción durante 60 días. Todas las barras = 3 mm.

En la Fig. 2 se muestran varias etapas de desarrollo y maduración de SE. Los SE inmaduros tempranos existieron y se multiplicaron en la etapa de proliferación de ET (Fig. 2a) después de un cultivo de proliferación de 7 a 10 días y el ET se usó para estimular la maduración de SE. En cultivo de maduración durante 5 días, los SE alcanzaron la etapa I de desarrollo embrionario y los SE eran esféricos (Fig. 2b). Los SE se desarrollaron hasta la Etapa II después de 10 días en el cultivo maduro, y el SE era cilíndrico (Fig. 2c). Después de ser cultivados durante 30 días, los SE comenzaron a desarrollar cotiledones en el estadio III (Fig. 2d). Los cotiledones continuaron alargándose después de que los SE se cultivaron durante aproximadamente 45 días en medio de maduración en la etapa IV (Fig. 2e). Los embriones somáticos maduraron completamente con cotiledones bien desarrollados en la etapa de desarrollo V, después de 60 días en cultivo (Fig. 2f).

Embriones somáticos en diferentes etapas de desarrollo en abeto azul. (a) SE inmaduros tempranos en cultivo de proliferación ET durante 7 a 10 días, barra = 50 μm; (b – f) El SE en cultivo de maduración durante 5 días (b), 10 días (c), 30 días (d), 45 días (e) y 60 días (f) respectivamente. Barras (b–f) = 2 mm.

Cuando no se complementó con 2, 4-D en el medio de cultivo, se observaron pocos SE inmaduros tempranos en ET y la estructura de los SE era pobre (Fig. 3a), ya que los SE consistían en embriones pequeños y sueltos y suspensores menos organizados; Cuando las concentraciones de 2,4-D se dispusieron de 1,0 a 4,0 mg/L, se estimaron más SE que el cultivo sin 2,4-D en el medio (Fig. 3b-e); el número de SE tempranos en el ET comenzó a disminuir cuando se suplementaron 6,0 mg/L de 2,4-D (Fig. 3f), en comparación con las Fig. 3c-e. En los seis tratamientos, la concentración óptima de 2,4-D fue de 3,0 mg/L (Fig. 3d), con lo que se obtuvo el mayor número de SE y las mejores características morfológicas de SE, es decir, el embrión denso propiamente dicho con un suspensor bien desarrollado, se obtuvieron.

Efectos del 2,4-D sobre la estructura de ET durante la proliferación en abeto azul. (a) ET en el cultivo cuando el 2,4-D estaba ausente del medio; (b) ET en cultivo de proliferación suplementado con 1,0 mg/l de 2,4-D; (c) ET en cultivo de proliferación suplementado con 2,0 mg/l de 2,4-D; (d) ET en cultivo de proliferación suplementado con 3,0 mg/l de 2,4-D; (e) ET en cultivo de proliferación suplementado con 4,0 mg/l de 2,4-D; (f) ET en cultivo de proliferación suplementado con 6,0 mg/l de 2,4-D. Las flechas apuntan a embriones somáticos. Todas las barras = 50 µm.

Existieron diferencias significativas entre los cultivos del control (2,4-D estaba ausente en el medio de cultivo) y aquellos que contenían 2,4-D en algunas concentraciones específicas (Fig. 4a-e). Cuando las concentraciones de 2,4-D estaban en el rango de 0,0 a 2,0 mg/l, la tasa de proliferación aumentó con el aumento de 2,4-D en todas las líneas celulares (Fig. 4a-d). Cuando las concentraciones de 2,4-D se ubicaron entre 0,0 y 3,0 mg/L, la tasa de proliferación de la línea celular 1#16 aumentó con las concentraciones más altas de 2,4-D, mientras que la tasa de proliferación disminuyó cuando la concentración de 2,4-D superó 4,0. mg/l (figura 4c). Con la línea celular 2#04, 4 mg/L de 2,4-D parece dar un alto número de SE maduros. Sin embargo, sólo fue estadísticamente significativo para el control sin el suplemento de 2,4-D al cultivo. Con las cuatro líneas celulares, la tasa de proliferación más alta se logró cuando se agregaron 2,0 mg/l de 2,4-D al medio de cultivo (Fig. 4e).

Efectos de las concentraciones de 2,4-D suplementadas en la etapa de proliferación tisular sobre la proliferación de ET y la maduración de SE con diferentes líneas celulares en abeto azul. (a) Proliferación de la línea celular 2#04; (b) Proliferación de la línea celular 2#13; (c) Proliferación de la línea celular 1#16; y (d) Proliferación de la línea celular 2#02; (e) Proliferación de todas las líneas celulares; (f) Maduración de la línea celular 2#04; (g) Maduración de la línea celular 2#13; (h) Maduración de la línea celular 1#16; y (i) Maduración de la línea celular 2#02; (j) Maduración de todas las líneas celulares. Media ± SE, N = 5 para líneas individuales o 20 para las cuatro líneas, diferentes letras minúsculas indican una diferencia significativa en p ˂ 0,05.

En los cultivos de maduración SE, existieron diferencias significativas entre el control y los tratamientos de algunas concentraciones específicas de 2,4-D (Fig. 4f-g). Cuando las concentraciones de 2,4-D oscilaron entre 1,0 y 4,0 mg/L (Fig. 4a), no hubo diferencias significativas en el desarrollo y maduración de SE con la línea celular 2#04 (Fig. 4f); La línea celular 2#13 mostró mayor capacidad de proliferación que las demás con concentraciones de 2,4-D entre 1,0 y 2,0 mg/L (Fig. 4b), y la ET tuvo la mayor capacidad proliferativa con 2,0 mg/L, mientras que 1,0 mg/L. L 2,4-D resultó en el mayor número de SE maduros (408 ± 230 SE maduros / g FW) (Fig. 4g); La línea celular 1#16 tuvo la mayor capacidad de proliferación cuando la concentración de 2,4-D fue de 3,0 mg/L (Fig. 4c), la capacidad de desarrollo/maduración de SE fue la mejor (318 ± 84 SE maduros/ g FW) (Fig. 4h); La línea celular 2#02 mostró la mayor capacidad de proliferación a una concentración de 2,4-D de 2,0 mg/L (la tasa de proliferación alcanzó hasta 1473,7 ± 556,0%, Fig. 4d), mientras que a 6,0 mg/L, el desarrollo/maduración de SE la capacidad fue la mejor (333 ± 37 SE maduros / g FW) (Fig. 4i). Con las cuatro líneas celulares, la mayor capacidad de maduración de SE se logró cuando se complementó con 1,0 mg/l de 2,4-D en el medio de cultivo (Fig. 4j).

El efecto de la concentración de 6-BA sobre la estructura de ET de las cuatro líneas celulares se muestra en la Fig. 6. Cuando no se agregó 6-BA al medio, el número de SE tempranos en ET fue menor que el del tejido tratado con 1 mg/L de 6-BA (Fig. 5a). El embrión propiamente dicho estaba bien organizado, pero los SE eran pequeños; Cuando las concentraciones de 6-BA oscilaron entre 0,5 y 3 mg / L, la diferencia en el número de SE tempranos en ET no fue obvia (Fig. 5b-e). Cuando se suplementaron 2 mg/L de 6-BA en el cultivo, los embriones inmaduros tempranos parecían sanos, porque el tamaño del SE era relativamente mayor, las células estaban densamente empaquetadas en el embrión propiamente dicho y los suspensores estaban claramente definidos.

Efectos de las concentraciones de 6-BA sobre la capacidad de diferenciación de SE en abeto azul. (a) proliferación de ET en el cultivo sin 6-BA; (b – e) ET en el cultivo de proliferación de 0,5 mg/L de 6-BA, 1,0 mg/L de 6-BA (c), 2,0 mg/L de 6-BA (d) y 3,0 mg/L de 6-BA ( e) respectivamente. Las flechas apuntan a embriones somáticos. Todas las barras = 50 µm.

Existieron diferencias significativas entre el control (el 6-BA estaba ausente en el medio de cultivo) y los tratamientos de algunas concentraciones específicas de 6-BA (Fig. 6a-e). No fue beneficioso para la proliferación de ET cuando las concentraciones de 6-BA eran demasiado altas o demasiado bajas (Fig. 6). Con el aumento de las concentraciones de 6-BA desde cero, la tasa de proliferación de ET aumentó primero y luego disminuyó. La línea celular 2#04 tuvo una tasa de proliferación más alta cuando la concentración de 6-BA era de 2,0 a 3,0 mg/l (Fig. 6a). La línea celular 2#13 mostró la tasa de proliferación más alta (721,0 ± 15%) cuando se complementó con 0,5 mg/l de 6-BA (Fig. 6b); La línea celular 1#16 tuvo la tasa de proliferación más alta (520,0 ± 49,8%) cuando la concentración de 6-BA fue de 2,0 mg/L (Fig. 6c), mientras que la línea celular 2#02 logró mejores tasas de proliferación cuando las concentraciones de 6-BA oscilaron entre 0,5 y 3,0 mg/L (Fig. 6d). Con las cuatro líneas celulares, la tasa de proliferación de ET más alta se logró cuando se suplementaron 2,0 mg/l de 6-BA en el medio de cultivo (Fig. 6e).

Efectos de las concentraciones de 6-BA suplementadas en la etapa de proliferación tisular sobre la proliferación de ET y la maduración de SE con diferentes líneas celulares en abeto azul. Media ± SE, N = 5 para líneas individuales o 20 para las cuatro líneas. Letras minúsculas diferentes indican una diferencia significativa en p ˂ 0,05.

Cuando la concentración de 6-BA fue de 2,0 o 3,0 mg/l, la línea celular 2#04 demostró tasas de proliferación más altas, mientras que la capacidad de maduración de SE fue pobre. Cuando se suplementaron 0,5 mg/l de 6-BA, la capacidad de maduración de SE fue la mejor (400 ± 83 SE maduros/g FW) (Fig. 6f). Con la línea celular 2#13, la capacidad de maduración de SE fue mejor cuando la concentración de 6-BA fue de 1,0 mg/L (320 ± 101 SE maduro/g FW) (Fig. 6g); Para la línea celular 1#16, 2,0 mg/l de 6-BA dieron como resultado la tasa de proliferación más alta, mientras que no se observó ninguna diferencia significativa en la capacidad de maduración de SE (Fig. 6h); En la línea celular 2#02, no se encontraron diferencias significativas en la maduración de SE con diferentes concentraciones de 6-BA aplicadas en la etapa de proliferación (Fig. 6i).

Los efectos de diferentes concentraciones de sacarosa en la estructura/morfología de la ET en las cuatro líneas celulares se muestran en la Fig. 7. Cuando la concentración de sacarosa fue de 5 o 10 g/L, el número de SE inmaduros tempranos en la ET fue mayor que los de las otras concentraciones y las características morfológicas de los SE se veían mejor (Fig. 7a, b) con estructuras más organizadas. Cuando la sacarosa se aumentó a 20 g / L, la cantidad de SE en la ET se redujo (Fig. 7c). Cuando se suplementaron 30 g/L de sacarosa, el número de SE en los ET disminuyó claramente (Fig. 7d), en comparación con las Fig. 7b y c.

Efectos de las concentraciones de sacarosa sobre la formación de SE en ET en la etapa de proliferación tisular en abeto azul. (a – d) Cultivo de proliferación ET suplementado con 5 g/L de sacarosa (a), 10 g/L de sacarosa (b), 20 g/L de sacarosa (c) y 30 g/L de sacarosa, respectivamente. Las flechas apuntan a embriones somáticos inmaduros tempranos. Todas las barras = 50 µm.

Se encontró una diferencia significativa en la proliferación de ET entre los tratamientos de algunas concentraciones específicas de sacarosa en las líneas celulares 2#02 y 1#16. En la línea 2#02, la mejor proliferación tisular se obtuvo con las mayores concentraciones de sacarosa (Fig. 8d), mientras que fue lo contrario con la línea celular 1#16 (Fig. 8c). La línea celular 2#04 tuvo una tasa de proliferación de ET más alta (412,6 ± 74,0%) cuando se usaron 10 g/L de sacarosa (Fig. 8a), mientras que fue de 20 g/L de sacarosa para la línea celular 2#13 (Fig. 8b). . La línea celular 1#16 logró la tasa de proliferación más alta (413,4 ± 30,2%) cuando se complementó con 10 g/l de sacarosa (Fig. 8c). Para la línea celular 2#02, las tasas de proliferación fueron mayores con 10 a 30 g/l de sacarosa que con 5 g/l de sacarosa (Fig. 8d). Con las cuatro líneas celulares, la tasa de proliferación de ET más alta se logró cuando se suplementaron 10 o 20 mg/l de sacarosa en el medio de cultivo (Fig. 8e). Se pudo encontrar una diferencia significativa en la maduración de SE entre los tratamientos de algunas concentraciones específicas de sacarosa (Fig. 8f-i) solo en las líneas celulares 2#04 (Fig. 8f) y 2#13 (Fig. 8g). Con estas dos líneas, las mayores concentraciones de sacarosa redujeron la capacidad de maduración del SE. No se encontraron diferencias significativas en la prueba de sacarosa con las cuatro líneas celulares juntas (Fig. 8j).

Efectos de las concentraciones de sacarosa suplementadas en la etapa de proliferación tisular sobre la proliferación ET y la maduración SE con diferentes líneas celulares en abeto azul. Media ± SE, N = 5 para líneas individuales o 20 para las cuatro líneas, diferentes letras minúsculas indican una diferencia significativa en p ˂ 0,05.

Los reguladores del crecimiento vegetal (PGR) juegan un papel importante en diferentes especies durante todo el proceso de embriogénesis somática25,26,27,28, como la inducción de ET (Phoenix dactylifera), la proliferación de ET (Pinus sibirica y Larix sibirica) y el desarrollo/maduración de SE. (Medicago sativa)24,29,30. Por lo tanto, es crucial conocer los efectos potenciales de los PGR aplicados de forma exógena sobre la embriogénesis somática. El 2,4-D, que funciona como auxina, se considera el regulador más crítico durante la inducción de ET en coníferas31,32. En este estudio, cuando el 2,4-D estaba ausente del medio de cultivo, las tasas de proliferación de ET de las cuatro líneas celulares fueron bajas y la capacidad de maduración de SE, en la siguiente etapa, también fue pobre. Así, se confirmó que el suplemento de 2,4-D es esencial para la proliferación de ET. También se encontraron diferencias significativas en la maduración SE en determinadas líneas celulares. Cuando la concentración de 2,4-D alcanzó 6,0 mg/L, el número de SE inmaduros tempranos disminuyó en ET. En la etapa de maduración de SE, a excepción de la línea celular 2#02, el número de SE maduros/g de FW disminuyó notablemente. La línea celular 1#16 incluso perdió su embriogenicidad. Estos demostraron el hecho de que si la concentración de 2,4-D es demasiado alta, la proliferación de ET o la maduración de SE se verán afectadas negativamente.

Muchas evidencias han demostrado que el uso simultáneo de citoquinina y auxina durante la proliferación de ET es más efectivo que el uso único y que estos dos PGR son sinérgicos hasta cierto punto, como en Acacia arabica33. En este experimento, cuando el 6-BA estaba ausente del medio, la tasa de proliferación de ET y la capacidad de maduración de SE fueron menores que las del 6-BA agregado, en las cuatro líneas celulares. Con el aumento de las concentraciones de 6-BA, las tasas de proliferación de ET aumentaron gradualmente. Por tanto, el 6-BA es necesario para la proliferación de ET, aunque la capacidad de maduración de SE no mostró diferencias significativas. En comparación, las concentraciones de 2,4-D demostraron un mayor efecto sobre la tasa de proliferación de SE que el 6-BA. Cuando el 6-BA superó los 2,0 mg/l, la tasa de proliferación de ET disminuyó en la línea celular 2#13. En la línea celular 1#16, cuando el 6-BA supera los 3,0 mg/l, tanto la tasa de proliferación como la capacidad de maduración del SE disminuyeron. Todos los hechos revelan que la concentración óptima de 6-BA juega un papel importante. Mientras tanto, este estudio también encontró que, dado que el 2,4 D y el BA afectan la tasa de proliferación, pero dependen en gran medida de la línea celular.

Para los embriones de coníferas, las concentraciones de sacarosa en el rango del 1% al 3% dieron como resultado un mejor desarrollo34. Para algunas especies de árboles, la glucosa y la maltosa son fuentes de carbono preferibles; por ejemplo, un 2% de maltosa fue mejor para la inducción de ET que un 2% de sacarosa en Pinus nigra35. Altas concentraciones de sacarosa podrían provocar plasmólisis celular, provocando así deshidratación y muerte de las células poco resistentes36. En este estudio, las respuestas a la sacarosa de diversas concentraciones fueron diferentes en las cuatro líneas celulares. Cuando la sacarosa era de 10 g/l, las tasas de proliferación de ET fueron mayores que otras concentraciones en las cuatro líneas celulares. Cuando la sacarosa estaba en el rango de 5 a 30 g/l, la capacidad de maduración del SE no fue significativamente diferente en las líneas celulares 1#16 o 2#02. Cuando la concentración de sacarosa aumentó hasta 30 g/l, la capacidad de maduración SE de las líneas celulares 2#04 y 2#13 disminuyó. Sin embargo, se pudo observar un cierto número de SE inmaduros tempranos en todos los tratamientos de concentraciones de sacarosa, lo que indica que la concentración de sacarosa no fue el factor principal que promovió los SE tempranos. El número de SE tempranos en ET disminuyó cuando la sacarosa alcanzó 30 g/L, lo que puede atribuirse al alto potencial osmótico del cultivo, lo que resultó en una pobre proliferación de ET.

En este estudio, hubo diferencias significativas en la inducción de ET entre las dos procedencias utilizadas en esta investigación y la tasa de inducción más alta fue de 78,8% ± 12,5% (F2), la más baja fue de 62,50 ± 12,8% (F1). Dado que el protocolo de inducción de ET no se modificó significativamente en comparación con el anterior1, las tasas de inducción mucho más altas en esta investigación pueden deberse a las diferentes fuentes de explante y/o a la mejor operación en detalles.

Cabe mencionar que la proliferación de ET no siempre va de acuerdo con la maduración de SE. Cuando los parámetros dados se evaluaron con las cuatro líneas celulares individuales, las diferencias entre ellas son evidentes. Es un conocimiento general que el protocolo deseado de embriogénesis somática debe adaptarse a todas las líneas celulares. Sin embargo, en la práctica no se pudo desarrollar ningún protocolo de este tipo. De hecho, se seleccionará un protocolo que se ajuste a la mayoría de las líneas celulares para reducir el costo. Esta investigación reveló que existía la marcada diferencia entre las culturas que se ajustaban a líneas individuales respectivamente. Por lo tanto, para líneas celulares de élite, por ejemplo líneas de alta ganancia genética, se recomienda encarecidamente el desarrollo de protocolos sobre la base de las respuestas del genotipo si el protocolo de cultivo general no funciona adecuadamente para líneas celulares específicas que son esenciales en la práctica. Según los resultados de esta investigación, el medio de cultivo general para la proliferación de ET para todas las líneas celulares fue mLV como medio basal suplementado con 2,0 mg/L de 2,4-D, 2 mg/L de 6-BA, 10 g/L de sacarosa. , 0,8 g/l de hidrolizado de caseína, 0,5 g/l de l-glutamina y 4 g/l de Gelrite, mientras que en Sun y Jia4 se utilizó medio 1/2LM como medio basal suplementado con 1,0 mg/l de 2,4-D. 0,5 mg/L de 6-BA, 0,5 mg/L de KT y la tasa de proliferación de callo embrionario más alta fue del 102,27 %. En Tao et al.1, se complementó 1/2 LM con 6,25 µM (1,38 mg/L) de 2,4- D, 3,75 µM (0,84 mg/L) de BA para cultivos líquidos y 7,5 µM (1,69 mg/L) de BA, 12,5 µM (2,76 mg/L) de 2,4-D para cultivos sólidos y la mayor tasa de proliferación de callos embrionarios. fue del 179,1%. Con el protocolo optimizado en este estudio, la tasa de proliferación de ET podría aumentar hasta 1473,7 ± 556,0%. Además, en estudios previos, las condiciones de cultivo de proliferación ET y maduración SE a menudo se consideraban por separado. Se han publicado pocos estudios sobre la influencia de las culturas, es decir, la etapa cultural anterior sobre la siguiente. Este estudio encontró que los componentes del cultivo en la etapa de proliferación de ET no solo afectaron la proliferación de ET, sino que también impactaron la maduración de SE en la etapa siguiente por las concentraciones específicas de 2,4-D y 6-BA, lo cual no se ha informado en estudios previos. en abeto azul.

Los datos y materiales del presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Todos los datos generados y/o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Rongzhou Man (Instituto de Investigación Forestal de Ontario, Canadá) y al Dr. Yuhui Weng (Facultad de Silvicultura y Agricultura Arthur Temple, Universidad Estatal Stephen F. Austin, EE. UU.) por su orientación y ayuda en este documento.

Esta investigación cuenta con el apoyo del Proyecto Principal de Ciencia y Tecnología "Investigación sobre tecnologías de recolección y preservación de recursos de germoplasma en los árboles de la montaña Changbai" del Departamento Forestal Provincial de Jilin (2015-002), el Proyecto de Promoción y Demostración de Ciencia y Tecnología Forestales, "Promoción de tecnologías de propagación eficientes en picea azul" financiada por la Finanzas Central de China (Nº JLT2021-10).

Academia Provincial de Ciencias Forestales de Jilin, 3528 Linhe St., Changchun, 130033, Jilin, China

Fang Gao, Xi Cao, Caiyun Qin, Shigang Chen, Jufeng Cai y Jing Tao

Facultad de Horticultura de la Universidad Agrícola de Jilin, 2888 Xincheng St., Changchun, 130118, Jilin, China

Xi Cao

Academia Forestal de Changchun, 5840 Jingyue St., Changchun, 130117, Jilin, China

Sol de Changbin

Centro de Biología Forestal, Departamento de Biología, Universidad de Victoria, Victoria, BC, V8W 3N5, Canadá

Lisheng Kong

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Conceptualización, JT; Análisis formal, FG y XC; Adquisición de financiación, JT; Investigación, FG, XC, CQ, SC, JC y CS; Supervisión, JT; Redacción: borrador original, FG, XC, CQ, SC y JC; Escritura: revisión y edición, LK y JT

Correspondencia a Jing Tao.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Gao, F., Cao, X., Qin, C. et al. Efectos de los reguladores del crecimiento vegetal y la sacarosa sobre la proliferación y calidad del tejido embriogénico en Picea pungens. Informe científico 13, 13194 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39389-8

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Recibido: 03 de abril de 2023

Aceptado: 25 de julio de 2023

Publicado: 14 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39389-8

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