Los niveles más altos de expresión de elastasa LasB de Pseudomonas aeruginosa se asocian con

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14208 (2023) Citar este artículo

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Pseudomonas aeruginosa es un patógeno común en pacientes con fibrosis quística (FQ) y un importante contribuyente al daño pulmonar progresivo. La elastasa de P. aeruginosa (LasB), un factor de virulencia clave, ha sido identificada como un objetivo potencial para la terapia antivirulencia. Aquí, buscamos diferenciar los aislados de P. aeruginosa de las etapas de infección tempranas versus las establecidas en pacientes con FQ y determinar si LasB estaba asociado con cualquiera de las etapas. El gen lasB se amplificó a partir de 255 aislamientos clínicos de P. aeruginosa de 70 pacientes con FQ de la región de Toulouse (Francia). Se identificaron nueve variantes de LasB y el 69% de los aislados produjeron niveles detectables de actividad LasB. La agrupación jerárquica utilizando datos experimentales y clínicos distinguió dos clases de aislamientos, designados como infección "temprana" y "establecida". El análisis multivariado reveló que los aislados de la clase de infección temprana muestran mayor actividad LasB, crecimiento rápido, susceptibilidad a la tobramicina, colonias pigmentadas no mucoides y genotipo lasR de tipo salvaje. Estos rasgos se asociaron con pacientes más jóvenes con infecciones polimicrobianas y pFEV1 alto. Nuestros hallazgos muestran una correlación entre la actividad elevada de LasB en aislados de P. aeruginosa y la infección en etapa temprana en pacientes con FQ. Por lo tanto, es este grupo de pacientes, antes de la aparición de la enfermedad crónica, el que puede beneficiarse más de las nuevas terapias dirigidas a LasB.

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética causada por una mutación que conduce a la pérdida total o parcial de la función del regulador de conductancia transmembrana de la FQ (CFTR), una proteína responsable del transporte de iones a través de las membranas apicales de las células epiteliales. La FQ es una enfermedad multisistémica que afecta al pulmón, el páncreas y el tracto digestivo, el sistema reproductor masculino y otros órganos glandulares1. Los pulmones de la FQ son propensos a las infecciones y Pseudomonas aeruginosa es una de las bacterias más comunes que colonizan este nicho2. P. aeruginosa es un patógeno oportunista gramnegativo, ubicuo en la naturaleza, cuyo genoma versátil y su importante adaptabilidad funcional le permiten prosperar en diversos ambientes3. La adaptación de P. aeruginosa al ambiente hostil y a la presión selectiva del pulmón con FQ conduce al establecimiento de infección crónica, resistencia a los antibióticos y pérdida de factores de virulencia como la motilidad, la secreción tipo III, las exotoxinas y las proteasas4,5,6. En el pulmón con FQ, el establecimiento de una infección crónica por P. aeruginosa se ha correlacionado con la disbiosis y el desarrollo de un microbioma promotor de la enfermedad7. Las infecciones crónicas por P. aeruginosa también se han descrito en otras enfermedades respiratorias, como las bronquiectasias no relacionadas con FQ (NCFB) y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)8,9.

El éxito de la colonización por P. aeruginosa reside en su capacidad para producir una gran variedad de factores de virulencia, incluidas toxinas y proteasas10,11, bajo el control de un sistema regulador de detección de quórum (QS)12,13. El sistema QS se compone de cuatro vías conocidas, a saber, LasR/LasI, RhlR/RhlI, el sistema de quinolonas controladas por PqsR y el sistema IQS. Los reguladores están organizados en una jerarquía, con LasR en la cima14. La elastasa LasB, la proteína más abundante en el secretoma, es un factor de virulencia clave expresado bajo el control del regulador positivo LasR15,16. De hecho, la expresión de LasB puede reducirse drásticamente en mutantes ΔlasR17 o mediante la adición de inhibidores de detección de quórum, como el transcinamaldehído, al medio de cultivo18. Esta proteasa extracelular tiene numerosos sustratos bacterianos y del huésped y provoca daño tisular e inflamación en el huésped19,20. Recientemente, un estudio demostró que LasB también promueve la infiltración de eosinófilos y la producción de mucina21. Además, se ha demostrado que la presencia de LasB es importante en el establecimiento de una infección crónica en ratones22.

LasB ha sido identificado como un objetivo potencial para la terapia antivirulencia, como alternativa o complemento a los antibióticos19. Para comprender mejor cómo se podría dirigir una terapia de este tipo para tratar a los pacientes con FQ, buscamos diferenciar los aislados de P. aeruginosa de las etapas tempranas versus establecidas (crónicas) de la infección por FQ y determinar si la expresión/actividad de LasB estaba asociada con cualquiera de las etapas. En este estudio, investigamos la presencia de los genes lasB y lasR, la prevalencia de diferentes variantes de LasB y la producción de LasB activo en 255 aislamientos de esputo de P. aeruginosa de 70 pacientes con FQ. Aplicamos un análisis multivariado, utilizando datos clínicos y experimentales, para identificar las variables que discriminan entre aislados de infecciones tempranas y establecidas y determinar si alguno de los grupos está más fuertemente asociado con niveles más altos de expresión de LasB.

Las 255 cepas de P. aeruginosa utilizadas en este estudio se aislaron de muestras de esputo recolectadas de 70 pacientes con FQ entre enero de 2015 y junio de 2020 (1 a 14 aislamientos por paciente) (Tabla 1 y Figura complementaria S1). Se incluyeron pacientes tanto pediátricos como adultos y la mediana de edad (en el momento de la primera muestra) fue de 12 años (rango 1-47). El pFEV1 se registró en el momento del muestreo, excepto en los pacientes más jóvenes (< 6 años). Los genotipos CFTR estaban disponibles para todos los pacientes excepto siete; 36 (51%) portaban mutaciones que conducían a un procesamiento y tráfico anormales (Clase II) en ambos alelos del locus CFTR23,24 de los cuales 32 eran homocigotos para la deleción F508. El estado de infección de los pacientes se clasificó según los 'criterios de Leeds', como Crónica (P. aeruginosa aislada de > 50% de las muestras en los últimos 12 meses), Intermitente (≤ 50% de las muestras en los últimos 12 meses) o Nueva (P. aeruginosa aislada por primera vez)25,26. Cuando se obtuvieron múltiples aislamientos de P. aeruginosa del mismo paciente durante el transcurso del estudio, la clasificación evolucionó en consecuencia, por lo que cada aislado se asoció con el estado de infección del paciente en el momento del muestreo. Según estos criterios, el 26% de los pacientes tenían una infección crónica por P. aeruginosa diagnosticada antes o durante el período del estudio.

Para 137 aislamientos, los datos estaban disponibles sobre el fenotipo mucoide, que se registró inmediatamente después de su aislamiento a partir de las muestras de esputo. Posteriormente se obtuvo información sobre el tamaño de las colonias y la pigmentación para un subconjunto separado, pero superpuesto, de 98 aislados de P. aeruginosa que habían sido seleccionados para el análisis multivariado. La proporción de aislados que muestran rasgos fenotípicos distintos dentro de cada categoría de Leeds se comparó con la proporción esperada si estos rasgos se distribuyeran aleatoriamente en la población mediante una prueba de Chi2 (Tabla complementaria S1 y Figura complementaria S2). Entre los aislados crónicos, el 47% tenía colonias puntiformes muy pequeñas, el 47% eran mucoides y el 31% tenían colonias pigmentadas. Los dos primeros rasgos fueron superiores a la proporción esperada (valores p ajustados: 1,33 × 10−3 y 1,69 × 10−5, respectivamente), mientras que el último (pigmentación) fue inferior a lo esperado (valor p ajustado: 0,02) . En el grupo Intermitente, el 16% de los aislados tenían colonias muy pequeñas, el 68% tenían pigmentación (no significativa) y ninguno de ellos era mucoide (valor p ajustado: 1,89 × 10-3). Finalmente, en el grupo Nuevo, el 5% de los aislados tenían colonias muy pequeñas y el 7% eran mucoides, los cuales fueron inferiores a la proporción esperada (valores de p ajustados: 1,98 × 10−2 y 0,028, respectivamente), y el 66% estaban pigmentados (no significativo).

El gen lasB se amplificó y secuenció con éxito a partir de los 255 aislados de P. aeruginosa. Se identificaron nueve variantes de la proteína LasB, de las cuales tres juntas representaron el 94,5% de los aislados (Tabla 2), a saber, LasB-1 (idéntica a la secuencia de tipo salvaje PAO1), LasB-2 (cambio de aminoácido único S241G) y LasB-3 (cinco cambios de aminoácidos: Q102R, S241G, D244N, K282N, R471S). Se detectaron otras seis variantes con una, dos o cinco modificaciones de aminoácidos en uno a cinco aislados. El análisis de la base de datos del genoma de Pseudomonas.com27 (7960 genomas, de los cuales el 99,1 % incluía un locus lasB de longitud completa en el momento de escribir este artículo) reveló las mismas tres variantes principales, a saber, LasB-1 (47,4 %), LasB-2 (17,3 %) y LasB-3 (22,6%). Cinco de las seis variantes menores encontradas en este estudio también estaban representadas en la base de datos de Pseudomonas.com, que contenía 140 variantes adicionales. Como ya se informó en otro lugar28, siete de las ocho variantes de LasB, incluidas las tres variantes principales, tenían actividades específicas de LasB similares con respecto a la hidrólisis del sustrato Abz con una diferencia del doble entre sí, con la única excepción de LasB-9 que mostró menor actividad (Tabla 2).

La amplificación y secuenciación del locus lasR se logró con éxito en todos los aislados menos en uno. De estos, las proteínas predichas eran idénticas a LasR de PAO1 (WT) en 162 (63,8%) aislados, mientras que 36 (14,2%) portaban mutaciones que conducían a una proteína truncada y 56 (22,0%) contenían una o más mutaciones de aminoácidos. o pequeñas eliminaciones (2 o 5 aminoácidos) (Tabla complementaria S2). A modo de comparación, en la base de datos del genoma de Pseudomonas.com, el locus lasR estaba ausente en 1081 genomas (13,6%). Entre los genomas que contenían lasR, el 57,3% eran WT, el 30,8% codificaban una variante de LasR y el 11,9% un LasR truncado. Aunque el porcentaje de WT LasR es alto, este locus presenta una variabilidad considerablemente mayor que la observada para lasB.

La actividad de LasB se determinó siguiendo la hidrólisis del sustrato fluorescente Abz en los sobrenadantes de cultivos de P. aeruginosa. De los 255 aislamientos, 176 (69%) mostraron actividad LasB, mientras que 79 (31%) estaban por debajo del umbral positivo para la detección. Las 79 muestras negativas se analizaron adicionalmente mediante transferencia Western para evaluar la producción de proteína LasB (ejemplos presentados en la figura complementaria S3). De ellos, 29 mostraron una banda de 33 kDa correspondiente a la proteína LasB, mientras que 50 no mostraron proteína LasB. De este último grupo, 43 (86%) contenían una mutación en lasR, y se predijo que 27 (54%) de ellos conducirían a una proteína LasR inactiva.

Para minimizar el sesgo debido a la aparición de múltiples aislamientos contemporáneos del mismo paciente y así facilitar un análisis estadístico más significativo, la base de datos se perfeccionó siguiendo el flujo de trabajo presentado en la figura complementaria S4. Brevemente, cuando había más de un aislado de cada etapa de la infección de cualquier paciente, se seleccionaron representantes que eran fenotípica o genotípicamente distintos según su actividad LasB y sus genotipos lasB/lasR. Esto dio como resultado un conjunto de datos de 102 aislamientos "únicos" que se utilizó para investigar la correlación entre la actividad de LasB, medida por hidrólisis de Abz, y otras variables. Dentro de este conjunto, 70 aislados (68,6%) demostraron un nivel detectable de hidrólisis de Abz, es decir, LasB positivo, y 32 (31,4%) fueron negativos. La mediana de edad del grupo LasB positivo fue de 12 años y la mediana de pFEV1 fue 85, mientras que para el grupo LasB negativo, la mediana de edad fue de 22 años y la mediana de pFEV1 fue 71 (Tabla 3). No hubo diferencias significativas en la actividad de LasB entre las variantes de LasB (rango mediano: 7,76 × 108–1,48 × 1011) (Fig. 1a; las pruebas estadísticas y los valores de p se presentan en la Tabla complementaria S3). Por el contrario, los aislados con WT LasR mostraron una actividad elastasa significativamente mayor (mediana: 1,74 × 1011) que aquellos con una forma variante (mediana: 1,95 × 108) (sustituciones de aminoácidos o pequeñas deleciones) o truncada (mediana: 1,41 × 108). de LasR (Fig. 1b). Finalmente, los aislados de pacientes designados con infecciones crónicas mostraron una actividad LasB significativamente menor (mediana: 3,72 × 108) que los de nuevas infecciones (mediana: 1,58 × 1011) (Fig. 1c).

Distribución de la actividad LasB, medida por la hidrólisis de Abz, en aislados de P. aeruginosa dependiendo de (a) variante LasB, (b) variante LasR y (c) etapas de infección de Leeds. La hidrólisis del sustrato Abz en el eje Y se expresa como log10(RFU). Los límites inferior y superior del cuadro representan el percentil 25 y 75, respectivamente. La línea negra dentro del cuadro representa la mediana. Los valores atípicos están representados por los círculos. La línea discontinua roja indica el umbral positivo del ensayo. Las diferencias significativas se indican con las estrellas encima de los diagramas de caja. valor p: **< 0,01; ***< 0,001; ****< 0,0001.

Inicialmente, se realizó un análisis multivariado supervisado (sPLS-DA) en los 102 aislamientos del conjunto de datos refinado para identificar (i) las variables que discriminan entre las tres etapas de infección de Leeds (nueva, intermitente y crónica) y (ii) cuáles Las variables se correlacionan con la presencia de actividad LasB. Las variables utilizadas para este análisis incluyeron datos clínicos del paciente (edad, pFEV1, tiempo desde la primera infección, infección en los últimos 3 meses antes de la fecha de recolección de cada aislado, clase CFTR), características fenotípicas del aislado (hidrólisis de Abz, bacterias crecimiento, susceptibilidad a tobramicina y aztreonam, mucoidía y morfología de colonias) y datos genotípicos (variantes LasB y LasR) (archivo de datos complementario). El modelo mostró una buena separación entre los aislados Nuevos y Crónicos; sin embargo, el grupo Intermitente se definió de manera vaga y se superpuso a los grupos Crónico y Nuevo (Figura complementaria S5). Por lo tanto, este modelo no discriminó claramente entre los tres grupos y mostró un alto error de validación cruzada (32,1%).

Para generar un modelo mejorado que pudiera proporcionar información sobre la actividad de LasB y las variables correlacionadas, primero se clasificaron los mismos 102 aislamientos del conjunto de datos refinado utilizando un método de agrupamiento jerárquico. En este análisis, se excluyó la variable de la etapa de infección de Leeds, pero se mantuvieron todas las demás variables disponibles. Esta nueva agrupación reveló dos clases distintas (Fig. 2). Setenta y dos aislados se agruparon en la primera clase, de los cuales el 58,3% habían sido designados previamente como nuevos, el 27,8% intermitentes y sólo el 13,9% como crónicos, según los criterios de Leeds. La segunda clase estuvo compuesta por 30 aislamientos, de los cuales el 76,7% fueron Crónicos y el 23,3% Intermitentes. No hubo nuevos aislamientos presentes en esta clase. Además, en la primera clase, se observó una mayor abundancia de WT LasR (68%) y un mayor nivel de hidrólisis de Abz (mediana: 1,5 × 1011) en comparación con la segunda clase (50% WT LasR, mediana de hidrólisis de Abz: 1,56 × 108, Tabla complementaria S4). Designamos la primera y segunda clase como "Infección temprana" e "Infección establecida", respectivamente.

Agrupación jerárquica de los aislados del conjunto de datos refinados en clase de infección temprana (verde) e infección establecida (violeta). Los puntos de la derecha indican a qué etapa de infección de Leeds pertenece cada aislado.

Posteriormente, se realizó un nuevo sPLS-DA utilizando las clases de infección temprana y establecida. El Componente 1 mostró la mayor separación entre los dos grupos (Fig. 3a) e identificó las variables que más contribuyeron a la discriminación. El alto pFEV1, el rápido crecimiento bacteriano, la alta hidrólisis de Abz, la ausencia de P. aeruginosa aislada en los últimos 3 meses, las grandes colonias verdes no mucoides, la susceptibilidad a la tobramicina y la presencia de un gen codificante LasR WT fueron todas características correlacionadas y sobrerrepresentadas. en la clase de infección temprana. Por el contrario, los pacientes de mayor edad, el tiempo transcurrido desde la primera infección, la infección por P. aeruginosa en los últimos 3 meses, las colonias mucoides y de color blanco liso muy pequeño y las infecciones monomicrobianas fueron características correlacionadas y sobrerrepresentadas en la clase de infección establecida (Fig. 3b). El error de validación cruzada obtenido con este modelo fue del 3,2%, lo que indica un rendimiento considerablemente mejor que el sPLS-DA inicial.

sPLS-DA para discriminar entre las clases de infección temprana y establecida e identificar las variables discriminantes. ( a ) Parcelas individuales de los dos grupos de infección. (b) Cargas de las variables contribuyentes del componente 1. Los colores indican el grupo para el cual las variables tienen un valor medio máximo. Las variables con cargas positivas (a la derecha del eje Y) se correlacionan entre sí y se correlacionan negativamente con las variables con cargas negativas (a la izquierda del eje Y).

Para evaluar la potencial clonalidad de los aislados recolectados del mismo paciente, se realizó la tipificación por secuenciación multilocus (MLST) en un subconjunto de aislados del conjunto de datos refinado, seleccionando aquellos que se recolectaron del mismo paciente y estaban en el mismo grupo de Leeds ( Tabla complementaria S6). Los aislados podrían clasificarse en dos grupos, denominados infección única y coinfección. En el grupo de infección única, que comprende el 48 % de los pacientes analizados, todos los aislados recolectados de un solo paciente compartían el mismo tipo de secuencia (ST), pero exhibían diferencias genotípicas (secuencia lasB/lasR) o fenotípicas (producción de LasB). Para ciertos pacientes (p. ej., Pacientes 2, 10, 32, 75), este fue el caso aunque los aislados provinieran de la misma muestra de esputo. En otros pacientes (p. ej., el paciente 51), el mismo ST se mantuvo a lo largo del tiempo en diferentes muestras de esputo, aunque aparecieron mutaciones adicionales. Estos resultados respaldan la aparición de una microevolución de P. aeruginosa para adaptarse al entorno pulmonar de la FQ. En el grupo de coinfección, que comprende el 52 % de los pacientes analizados, los aislamientos del mismo paciente presentaron diferentes ST, lo que indica la presencia de múltiples cepas dentro de los pulmones al mismo tiempo (p. ej., pacientes 70 y 71) o infecciones secuenciales. con diferentes cepas de P. aeruginosa (p. ej., Pacientes 1, 16, 30). Cabe señalar que los pacientes con infecciones Intermitentes o Crónicas, fueron más abundantes en el grupo de Coinfección (91%), que en el grupo de Infecciones Únicas (70%).

Este estudio evaluó 255 aislamientos de P. aeruginosa recolectados de una cohorte de 70 pacientes con FQ de la región de Toulouse en Francia, durante un período de 4,5 años. Los médicos clasificaron a los pacientes según los criterios de Leeds25,26, que se utilizan ampliamente para definir el estadio de las infecciones por P. aeruginosa en pacientes con FQ. La P. aeruginosa aislada de los diferentes estadios de infección mostró características específicas; por ejemplo, P. aeruginosa de infecciones crónicas se asoció más fuertemente con fenotipos de colonias pequeñas y mostró una prevalencia significativamente mayor de mucoidía, al tiempo que mostró una prevalencia significativamente menor de pigmentación, en relación con los aislados de infección intermitente y nueva. Estas características ya han sido descritas como típicas de P. aeruginosa aislada de infecciones crónicas5,29,30 y están asociadas con una mayor resistencia a los antibióticos5 y una expresión reducida de factores de virulencia (como LasB), en relación con la cepa WT PA0129. El fenotipo de colonia pequeña observado aquí podría corresponder a las variantes de colonia pequeña (SCV) que se han descrito previamente en el contexto de la infección pulmonar crónica en pacientes con FQ31,32,33. Sin embargo, sería necesaria una caracterización adicional para distinguir los aislados de SCV de aquellos que presentan una tasa de crecimiento lenta.

La amplificación por PCR del locus lasB confirmó la presencia de este gen en todos los aislados, aunque en algunos casos fue necesario utilizar cebadores alternativos para lograr una buena amplificación. Algunos estudios han informado que el gen lasB está ausente en determinadas cepas clínicas34,35,36; sin embargo, otro estudio que analizó 162 aislados de FQ también detectó el gen lasB en todas las cepas37. Además, una evaluación de los datos genómicos de una colección de bronquiectasias de P. aeruginosa publicada por Hilliam et al.38 confirmó que el locus lasB también estaba presente en el 100% de esos aislados (datos no mostrados). Finalmente, el análisis de la base de datos global Pseudomonas.com reveló la presencia del locus lasB en el 99,1% de los genomas depositados, independientemente de su origen. Vale la pena señalar que los genomas que carecen del gen lasB se encuentran en su mayoría en el nivel de ensamblaje de cóntig/andamio, con solo dos en el nivel de ensamblaje de cromosoma/genoma completo, lo que sugiere que el gen lasB puede estar presente dentro de los espacios de los genomas incompletos, y sólo está verdaderamente ausente en una pequeña minoría de cepas. Por tanto, las discrepancias en la detección de lasB, entre diferentes estudios basados en PCR, pueden deberse a las técnicas utilizadas o a los cebadores empleados. Los datos presentados proporcionan pruebas sólidas de que el gen lasB está presente en la gran mayoría de las cepas de P. aeruginosa.

El análisis de las secuencias de aminoácidos de LasB reveló nueve variantes, tres de las cuales representaron el 94,5% de los 255 aislados de FQ analizados. Las mismas tres variantes principales se identificaron en el 87,3% de la base de datos global de Pseudomonas.com (n = 7890) y, curiosamente, también en el 83,1% de una colección de aislamientos de P. aeruginosa de pacientes con bronquiectasias sin FQ (n = 189; datos no mostrado)38. La distribución similar de variantes de LasB entre las diferentes bases de datos sugiere que este locus está bien conservado entre las cepas de P. aeruginosa. Siete de las nueve variantes de LasB identificadas en esta colección, incluidas las tres variantes principales, mostraron actividades específicas similares, y solo la variante LasB-9 mostró una actividad específica ligeramente menor28. Estos datos indican que la mayoría de P. aeruginosa, independientemente de su procedencia, tienen el potencial de expresar un LasB funcional.

De acuerdo con las observaciones anteriores, no se observaron diferencias significativas en la actividad de la elastasa entre aislados con diferentes variantes de LasB. Curiosamente, una pequeña proporción de aislados (11,4%) fueron capaces de producir proteína LasB, como lo demuestra la transferencia Western, pero no mostraron hidrólisis del sustrato Abz, a pesar de tener secuencias lasB que codifican enzimas activas. Cigana et al.22 han demostrado previamente que dos cepas aisladas del mismo paciente con 7 años de diferencia portaban la misma secuencia lasB y producían cantidades similares de proteína mediante Western blot pero tenían diferentes niveles de actividad elastasa. En ese estudio, el primer aislado mostró una fuerte actividad elastasa, mientras que la cepa aislada durante la infección crónica no tenía actividad elastasa detectable y presentaba rasgos fenotípicos patoadaptativos. Los autores sugirieron que la falta de actividad elastasa podría estar relacionada con un procesamiento incorrecto de la proteína. Es posible que un mecanismo similar explique la falta de actividad observada en ciertas cepas en este estudio.

La expresión de LasB está controlada por una compleja red QS, que responde a la densidad de células bacterianas y múltiples señales ambientales. Se han identificado varios reguladores transcripcionales de QS en P. aeruginosa; sin embargo, el principal regulador que controla la expresión de lasB es el activador LasR19. Las mutaciones que conducen a la inactivación de LasR se han descrito como una adaptación temprana al entorno pulmonar de la FQ y se han asociado con la progresión de la enfermedad pulmonar en pacientes con FQ39,40. Por otro lado, también se han observado mutaciones de un solo aminoácido en LasR en aislados de P. aeruginosa procedentes de infecciones crónicas, algunos de los cuales mantienen su actividad elastasa41. Por lo tanto, evaluamos la aparición de variantes de lasR en nuestra colección de aislados, así como la correlación de esas variantes con la hidrólisis del sustrato Abz. El locus lasR se amplificó y secuenció con éxito en 254 de los 255 aislados. De acuerdo con estudios anteriores, el 63,8% de las cepas presentaron un WT LasR, pero también se identificó una gran cantidad de variantes, incluido el 14,2% que codifica una proteína LasR truncada, que se asociaron con los niveles más bajos de actividad LasB. Zupetic et al. De manera similar, observaron que los genotipos lasR mutantes eran más abundantes entre las cepas de P. aeruginosa con bajo contenido de elastasa aisladas de infecciones respiratorias en una UCI42. Además, observamos que el grupo de infección crónica (según los criterios de Leeds) tenía la mayor proporción de aislados que portaban mutaciones en el locus lasR y el nivel más bajo de actividad LasB, lo que respalda la importancia de LasR en la expresión de LasB. Desafortunadamente, debido a la disponibilidad limitada de múltiples aislamientos de pacientes individuales en este estudio retrospectivo, no fue posible observar directamente si la actividad de la elastasa se redujo en aislamientos consecutivos a lo largo del tiempo (datos no mostrados). Para abordar esto, es posible que se requieran estudios prospectivos centrados en la obtención de datos longitudinales completos.

Para comprender mejor las correlaciones entre diferentes variables (tanto bacterianas como relacionadas con el paciente) y su vínculo con la actividad de la elastasa, se realizó un análisis multivariado supervisado en un conjunto de datos que se refinó para eliminar posibles muestras duplicadas que, de otro modo, podrían sesgar el análisis. Este modelo no discriminó entre los tres grupos de Leeds, probablemente porque las infecciones intermitentes están mal definidas y sus características comunes son difíciles de determinar26. Este hallazgo concuerda con estudios previos que han demostrado que muchos pacientes asignados a la categoría Intermitente probablemente tengan infecciones crónicas43,44.

Un análisis MLST de las cepas del conjunto de datos refinado que se aislaron del mismo paciente y que estaban en el mismo grupo de Leeds identificó aislamientos clonalmente relacionados que tenían diferencias genotípicas y/o fenotípicas relevantes, es decir, mutaciones en los loci lasB/lasR. o diferencias en la actividad de LasB. Estos resultados demuestran que P. aeruginosa evoluciona y se adapta al entorno pulmonar de la FQ y que pueden coexistir varios mutantes procedentes del mismo tipo de secuencia. Bragonzi et al.30 describieron previamente la microevolución de P. aeruginosa en el contexto de la FQ. En ese estudio demostraron que los aislados clonales portaban reordenamientos genómicos, mutaciones y variaciones en islas patógenas, así como variaciones fenotípicas que incluyen mucoidía y factores de virulencia. De hecho, las infecciones prolongadas por P. aeruginosa se han caracterizado por la acumulación de mutaciones en diversos genes, incluidos reguladores transcripcionales, factores de virulencia, susceptibilidad a los antibióticos y quorum sensing (lasR)4. Por el contrario, un grupo de pacientes presentó múltiples ST entre sus aislados, algunos de ellos aislados de una sola muestra de esputo y otros aislados en diferentes momentos. Las coinfecciones y las infecciones secuenciales o intermitentes por diferentes cepas de P. aeruginosa también se han descrito en la literatura45,46 y parecen ser un fenómeno común en el contexto de la FQ.

Para los fines de este estudio, buscamos definir un modelo que reflejara con mayor precisión las características de los aislados de P. aeruginosa y el estado clínico del paciente. Una clasificación jerárquica condujo a la identificación de dos clases distintas de aislamientos, que denominamos infección temprana e infección establecida, según sus propiedades, que luego se utilizaron en un segundo análisis multivariado supervisado. En este caso, la discriminación entre ambos grupos fue clara y se identificaron las principales variables discriminatorias.

Nuestro análisis reveló que características como una menor actividad de LasB, el fenotipo mucoide, colonias muy pequeñas, elevadas y lisas y la falta de pigmentación de las colonias estaban sobrerrepresentadas en la clase Establecida. Estos rasgos se correlacionaron con pacientes de mayor edad, con pFEV1 más bajo, que portaban infecciones por P. aeruginosa durante más tiempo, que habían tenido infecciones por P. aeruginosa en los últimos 3 meses y tenían infecciones monomicrobianas. Estas observaciones son consistentes con los informes de que los pacientes portadores de variantes de colonias pequeñas de P. aeruginosa adaptadas a los pulmones presentan una función pulmonar más deficiente y un pFEV133 significativamente más bajo.

Por el contrario, los aislados de infección temprana presentaron una mayor actividad LasB que se correlacionó con otros rasgos fenotípicos, como susceptibilidad a tobramicina y aztreonam, crecimiento bacteriano rápido, presencia de pigmentación, colonias planas no mucoides medianas o grandes, así como un LasR WT. Estos rasgos se asociaron con pacientes más jóvenes, portadores de infecciones polimicrobianas, con pFEV1 alto. En el contexto del entorno de la FQ, las cepas “ingenuas” de P. aeruginosa se adaptan mediante sucesivas modificaciones genéticas, incluida la sobreexpresión de algU, mutaciones en rpoN, gyrA y otros componentes de la ADN polimerasa, que en última instancia conducen a una disminución en la tasa de crecimiento. , afectando la tolerancia y persistencia de los antibióticos47. En nuestro modelo, el rápido crecimiento bacteriano, que refleja tasas de crecimiento más altas, estuvo sobrerrepresentado en la clase de infección temprana. Además, este rasgo se correlacionó con una mayor susceptibilidad a la tobramicina y el aztreonam, lo que es consistente con el fenotipo ingenuo.

Anteriormente se ha demostrado que LasB desempeña un papel importante durante la infección por P. aeruginosa y desencadena la inflamación del huésped48,49,50. A su vez, nuestros datos sugieren que LasB es más importante durante la fase inicial de la infección, ya que es la clase de infección temprana la que se caracteriza por una mayor actividad de LasB y la presencia de un LasR WT. Las mutaciones en el locus lasR que conducen a una pérdida de función se han asociado con una mayor respuesta de ICAM-1 y un aumento de la inflamación pulmonar neutrofílica, una mayor tolerancia a los antibióticos, así como una reducción de las actividades elastolíticas y caseinolíticas y una reducción de la producción de piocianina51,52. En nuestro estudio, la pérdida de actividad elastasa durante una infección a largo plazo (crónica) parece estar correlacionada con la pérdida de la función LasR, más que con cualquier mutación en el locus lasB en sí, aunque LasR no parece ser el único responsable de este fenotipo. De hecho, el 25,3% de los aislados que no mostraron actividad LasB (es decir, negativos para la hidrólisis de Abz) exhibieron un genotipo WT lasR, por lo que se requieren otros cambios en la regulación o procesamiento de LasB para explicar este fenotipo. De acuerdo con esto, si bien la presencia de un WT LasR se asoció claramente con la clase de infección temprana, el sPLS-DA no identificó mutaciones en lasR como una variable crítica para caracterizar la infección establecida.

Nuestro estudio combinó datos clínicos y experimentales asociados con 255 aislamientos de P. aeruginosa de un solo centro regional de FQ. Los resultados proporcionan un "panorama general" de la diversidad de cepas y el desarrollo evolutivo, lo que confirma muchas observaciones previas realizadas con conjuntos de datos más limitados, pero también revela la enorme complejidad de la diversidad fenotípica y genómica de P. aeruginosa dentro de esta población y dentro de pacientes individuales. Se realizó un análisis multivariado para identificar variables que diferencian entre aislamientos de P. aeruginosa de infección temprana y establecida, y específicamente aquellos rasgos fenotípicos y genotípicos que se correlacionan con la expresión de LasB activo. En conclusión, nuestros datos indican que los aislados de P. aeruginosa de pacientes con FQ expresan niveles más altos de actividad elastasa LasB durante las primeras etapas de la infección y que una vez que se establece una infección crónica, la actividad elastasa disminuye significativamente en muchas cepas, coincidiendo con la aparición de mutaciones en lasR, reducción de la tasa de crecimiento y aparición de resistencia a los antibióticos. Estos hallazgos sugieren que, en pacientes con FQ, las terapias antivirulencia dirigidas a la elastasa LasB pueden ser más efectivas para el tratamiento de infecciones en etapa temprana, antes de que se establezca la cronicidad.

Este estudio fue diseñado de acuerdo con la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial y realizado de conformidad con la legislación francesa aplicable a los estudios retrospectivos no intervencionistas (MR-004). Según la ley reguladora y de ética francesa, los estudios basados en la explotación de datos y muestras de cuidados habituales no tenían que presentarse a un comité de ética específico, sino que debían ser declarados o cubiertos por la metodología de referencia de la Comisión Nacional Francesa de Informática y Libertades. (CNIL). Se informó a los pacientes que sus datos codificados serán utilizados para el estudio y se recogió su consentimiento informado (no oposición) y se dejó un rastro en cada expediente médico. Antabio SAS firmó un compromiso de cumplimiento de la metodología de referencia MR-004 de la CNIL (número CNIL: 2229447 v 0). De este modo, el estudio fue aprobado por Antabio SAS después de la evaluación por parte del delegado de protección de datos y la confirmación de que se respetaron los requisitos éticos. Este estudio fue registrado con el número: PEi-042.

Se aislaron 255 P. aeruginosa de muestras de esputo obtenidas de 70 pacientes con FQ de varios centros de FQ en la región de Toulouse, Francia. Las muestras se recogieron durante visitas de rutina (cada 3 meses) y episodios de exacerbación pulmonar. Se recogieron muestras de esputo de pacientes con FQ de acuerdo con las Directrices francesas para la fibrosis quística53.

Las muestras de esputo se homogeneizaron con un volumen igual de ditiotreitol durante 30 min a 37 °C. Para el aislamiento de P. aeruginosa, se sembraron muestras de 10 µl de homogeneizado en placas de agar cetrimida (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia) y se incubaron a 35 (± 2) ° C durante 48 a 120 h. Se aisló y analizó una única colonia que representa cada morfotipo mediante espectrometría de masas MALDI-TOF (MALDI BioTyper, Bruker) para confirmar la identidad de P. aeruginosa. Las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) se realizaron utilizando la metodología estándar de difusión en disco de acuerdo con las directrices del CA-SFM/Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST)54. Se utilizó la cepa P. aeruginosa ATCC 27853 como control. La AST se realizó con los siguientes antibióticos: aztreonam (ATM), tobramicina (TOB), ticarcilina (TIC), ticarcilina-ácido clavulánico (TIM), piperacilina (PIP), piperacilina-tazobactam (TZP), ceftazidima (CAZ), cefepima ( FEP), imipenem (IMP), meropenem (MEM), gentamicina (GEN), amikacina (AMK), levofloxacina (LVX), ciprofloxacina (CIP), fosfomicina (FOF) y colistina (CST). Sólo se consideraron para el análisis estadístico los resultados de AST para ATM y TOB, ya que estos antibióticos son el estándar de atención para las infecciones por P. aeruginosa en la FQ. La determinación visual del fenotipo mucoide también se evaluó en un subconjunto de 137 aislados inmediatamente después del aislamiento para obtener un reflejo fiel del fenotipo de estas cepas en los pulmones, y no se volvió a evaluar posteriormente para evitar la aparición de reversiones. Las cepas se almacenaron a -20 °C en caldo Brain Heart Infusion (BHI) que contenía 10% de glicerol.

Se extrajo ADN genómico de cada aislado para la amplificación por PCR de los loci lasB y lasR. Primero, se recolectaron mediante centrifugación aproximadamente 4 × 108 células bacterianas de un cultivo en crecimiento exponencial y el sedimento se resuspendió en tampón TE (Tris-HCl, pH 8, 100 mM, EDTA, pH 8, 10 mM). Las células se congelaron a -80 °C durante 20 minutos y luego se transfirieron a un tubo con tapa de rosca con perlas de vidrio. Las muestras se homogeneizaron en el FastPrep-24 5G (MP Biomedicals) (5 ciclos de 30 s a velocidad 5,5), se centrifugaron y se recuperó el sobrenadante que contenía el ADN genómico. Se realizó una precipitación con etanol para concentrar el ADN.

La amplificación por PCR de lasB se realizó primero con los cebadores AmpF1/AmpR1 (Tabla complementaria S5) y se utilizó un segundo par (LasB_EF/LasB_ER) si el primer conjunto fallaba. La amplificación de lasR se realizó con los cebadores lasR_EF/lasR_ER (Tabla complementaria S5). Los productos de PCR se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR PureLink™ Pro 96 (Invitrogen) y Macrogen Europe los secuenciaron utilizando cebadores específicos.

Se examinó un total de 98 aislamientos de P. aeruginosa del conjunto de datos refinado para determinar la morfología de la colonia (forma, tamaño, margen, elevación) y pigmentación después de un crecimiento nocturno en agar LB a 37 °C. La pigmentación de las colonias se clasificó en blanca (sin pigmentación), verde o roja.

Se inocularon matraces que contenían caldo LB a una DO600 = 0,015 con un cultivo de P. aeruginosa durante la noche y se incubaron durante 24 h a 37 °C a 180 rpm. Los cultivos se centrifugaron durante 10 minutos a 5000 rpm y los sobrenadantes se filtraron (poro de 0,22 µm) y se almacenaron a -80 °C. Para cada experimento, se utilizaron la cepa PAO1 y un derivado de ΔlasB como controles positivos y negativos, respectivamente.

Se utilizó la hidrólisis del sustrato peptídico fluorogénico 2-aminobenzoil-Ala-Gly-Leu-Ala-4-nitrobencilamida (Abz; Enzo Life Sciences) para evaluar la actividad de LasB en los sobrenadantes de cultivo. El ensayo se realizó en Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) suplementado con CaCl2 2,5 mM y se siguió utilizando un lector de microplacas Envision (Perkin Elmer) con longitudes de onda de excitación de 315 nm y emisión de 430 nm. Los resultados se expresaron en UFR/mL de sobrenadante. Los sobrenadantes que mostraron menos de un umbral inicial de 1,88 × 108 UFR/ml (calculado como la media de los controles negativos más tres veces la DE) se consideraron negativos. Todos los aislados se analizaron una vez y, si los resultados estaban por debajo del umbral de positividad, se realizaron dos réplicas más para confirmar el resultado negativo.

La presencia de proteína LasB en los sobrenadantes se evaluó mediante análisis de transferencia Western. Se mezclaron veinticinco microlitros de sobrenadantes de cultivo con un volumen igual de un tampón azul de Laemmli 2 × y se desnaturalizaron calentando a 95 ° C durante 5 minutos. Se procesaron diez microlitros de muestra de proteína en geles de proteína prefabricados Mini-Protean TGX al 12% (Bio-Rad). Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF de 0,2 µm. Después de 1 h en TBST (solución salina tamponada con Tris-Tween 20) con leche desnatada al 5 % para saturar los sitios no específicos, las membranas se transfirieron durante 1 h a temperatura ambiente en TBST con leche desnatada al 0,5 % en presencia del anticuerpo primario LasB (siempre que por el laboratorio de Efrat Kessler, Universidad de Tel Aviv, Israel). El anticuerpo primario se detectó utilizando un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina y revelado con el sustrato NBT/BCIP (Sigma).

La MLST se realizó como se describió anteriormente55. Brevemente, los siete genes, ascA, aroE, guaA, mutL, nuoD, ppsA y trpE, se amplificaron mediante PCR utilizando los cebadores diseñados por Curran et al.55. Las amplificaciones se realizaron utilizando GoTaq G2 Hot Start Green Master Mix (Promega), los cebadores directo e inverso a una concentración final de 0,4 μM, DMSO al 6% y 100 ng de gDNA (4 ng/μL) en un volumen final de 25 µL. El programa de amplificación se estableció de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 45 s, hibridación a 55 °C durante 1 min y elongación a 72 °C durante 1 min, seguido por un alargamiento final a 72 °C durante 7 min. Después de la amplificación, se procesaron 5 μL de productos de PCR en un gel de agarosa al 1,3% para verificar el tamaño de los amplicones. Luego, las muestras se almacenaron a -20 °C antes de enviarlas a Microsynth para su purificación y secuenciación. Se analizaron secuencias de genes reconstruidos para determinar su perfil alélico. Finalmente, para cada cepa, el conjunto de perfiles alélicos obtenidos se utilizó para identificar el perfil ST56.

Todos los datos clínicos proporcionados por los centros de Toulouse CF y los datos experimentales se combinaron en un único conjunto de datos. Las medidas descriptivas para variables numéricas (medias, medianas, DE y rangos) se calcularon utilizando Vortex (Dotmatics).

Todos los siguientes análisis se realizaron en el software R57. Las comparaciones de la distribución esperada de un rasgo fenotípico y la distribución real dentro de los grupos de aislados con infección nueva, intermitente y crónica se realizaron utilizando la prueba de Chi-cuadrado de Pearson. La prueba se ejecutó utilizando la función 'chisq.test' del paquete 'stats'57.

Se creó un conjunto de datos refinado eliminando probables aislamientos duplicados para minimizar el sesgo durante el análisis estadístico. Los criterios de eliminación se detallan en el flujo de trabajo en la figura complementaria S4. También se excluyeron los aislados que se clasificaron como "Nueva infección" para pacientes mayores de 30 años y los aislados cuyos datos clínicos estaban incompletos. Todos los análisis estadísticos posteriores se realizaron con el conjunto de datos refinado.

Los diagramas de caja se generaron utilizando la función 'ggboxplot' del paquete 'ggpubr'58. Para determinar si existían diferencias significativas entre las medianas de los distintos grupos se realizó una prueba de Kruskal-Wallis utilizando la función 'kruskal.test'. La comparación por pares de las medianas se realizó con la prueba de Dunn, utilizando la función 'dunnTest' del paquete 'FSA'59.

El conjunto de datos refinado se normalizó para su posterior análisis. Las variables numéricas se centraron y escalaron, y las variables categóricas se transformaron en variables ficticias utilizando el paquete 'fastDummies'60. La clasificación de los aislados se realizó mediante un análisis de agrupamiento con la función 'hclust'. Se realizó un análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (sPLS-DA) utilizando la función 'splsda' del paquete 'mixOmixs'61. El número óptimo de componentes en el modelo se definió con la función 'perf' utilizando una validación cruzada triple repetida 1000 veces. El número de variables seleccionadas en el modelo se definió con la función 'tune.splsda'.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

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La investigación reportada en esta publicación cuenta con el respaldo de CARB-X. La financiación de CARB-X para este proyecto proviene en parte de fondos federales del Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU.; Administración para la Preparación y Respuesta Estratégica; Autoridad de Investigación y Desarrollo Biomédico Avanzado; bajo número de acuerdo: 75A50122C00028, y por adjudicación de Wellcome (WT224842). El contenido de esta publicación es responsabilidad exclusiva de los autores y no necesariamente representa las opiniones oficiales de CARB-X o cualquiera de sus patrocinadores. Los autores también desean agradecer a Joanne Fothergill y Craig Winstanley de la Universidad de Liverpool por proporcionar datos de secuencia de sus estudios NCFB publicados, y a la empresa Smaltis (Besançon, Francia) por proporcionar los datos de MLST.

Antabio SAS, Biostep, 436, rue Pierre et Marie Curie, 31760, Labège, Francia

Agustina Llanos, Pauline Achard, Justine Bousquet, Clarisse Lozano, Magdalena Zalacain, Carole Sable, Marc Lemonnier y Martin Everett

Departamento de Bacteriología-Higiene, Hospital Universitario de Toulouse, Toulouse, Francia

Hélène Revillet

IRSD, INSERM, Universidad de Toulouse, INRAE, ENVT, UPS, Toulouse, Francia

Hélène Revillet

Centro de Fibrosis Quística de Adultos, Unidad de Neumología, Hospital Larrey, Hospital Universitario de Toulouse, Toulouse, Francia

Marlène Murris

Hospitales de Toulouse, Toulouse, Francia

Marie Mittain

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ME concibió y diseñó el estudio. MMu, MMi y HR proporcionaron aislados, datos clínicos y aportaciones científicas. PA, JB, CL, HR, realizaron la caracterización fenotípica y genotípica de los aislados. AL realizó los análisis estadísticos. MMu, MMi, HR, PA, JB, CL, AL, CS, MZ, ML, ME contribuyeron a la interpretación y análisis de los datos. AL, PA, MZ, ML, ME redactaron el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondence to Agustina Llanos.

AL, PA, JB, CL, MZ, CS, ML y ME eran empleados de Antabio en el momento del estudio. RR.HH. no declara ningún potencial conflicto de intereses. MMu ha recibido una remuneración como consultora de Vertex. Ha recibido una remuneración como miembro de la junta directiva nacional francesa de Zambon y de la junta directiva de Viatris. MMi ha recibido una remuneración como consultora de Vertex.

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Llanos, A., Achard, P., Bousquet, J. et al. Los niveles más altos de expresión de elastasa LasB de Pseudomonas aeruginosa se asocian con una infección en etapa temprana en pacientes con fibrosis quística. Representante científico 13, 14208 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41333-9

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Recibido: 28 de febrero de 2023

Aceptado: 24 de agosto de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41333-9

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