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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 10342 (2023) Citar este artículo

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El virus de la peste porcina africana (PPA) es un patógeno animal letal que ingresa a las células huésped a través de endocitosis. Hasta ahora, apenas se han identificado los factores del huésped específicamente necesarios para la replicación del ASFV. En este estudio, una prueba de eliminación de CRISPR/Cas9 en todo el genoma en células porcinas indicó que los genes RFXANK, RFXAP, SLA-DMA, SLA-DMB y CIITA son importantes para la infección productiva por PPA. Las proteínas codificadas por estos genes pertenecen al complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC II) o complejo de antígeno leucocitario porcino II (SLA II). RFXAP y CIITA son factores de transcripción específicos del MHC II, mientras que SLA-DMA/B son subunidades de la molécula no clásica del MHC II, SLA-DM. La desactivación dirigida de cualquiera de estos genes provocó graves defectos de replicación de diferentes aislados de VPPA, lo que se refleja en una eficiencia de siembra sustancialmente reducida, la propagación de célula a célula, los títulos del virus de la progenie y la replicación del ADN viral. La reconstitución basada en transgenes de SLA-DMA/B restableció completamente la capacidad de replicación, lo que demuestra que SLA-DM, que reside en los endosomas tardíos, desempeña un papel crucial durante las primeras etapas de la infección por ASFV.

El virus de la peste porcina africana (PPA) es el agente causante de la peste porcina africana (PPA), una enfermedad hemorrágica de los cerdos domésticos y del jabalí (especie Sus scrofa)1,2,3. El virus de la peste porcina africana se identificó por primera vez en Kenia en 1921 y desde entonces se ha notificado en la mayoría de los países del África subsahariana4,5. Mediante la secuenciación parcial del gen B646L, que codifica la proteína principal de la cápside p72, se han especificado veinticuatro genotipos de PPA6,7. Hasta ahora, sólo dos de ellos, el genotipo I y el genotipo II, han sido detectados fuera de África, siendo el genotipo II el responsable de la panzoótica actual. Desde la introducción del virus de la peste porcina africana en Georgia en 2007, se han notificado brotes de peste porcina africana en países de la región europea, la federación rusa, Asia, Oceanía y América3,8,9 (sitio web de la OIE-Wahis, visitado en noviembre de 2022). En la mayoría de los países afectados, el control de la peste porcina africana todavía se limita a medidas de gestión de riesgos biológicos, enfoques de vigilancia y estrategias de respuesta, que incluyen el sacrificio selectivo y restricciones comerciales, y provocan importantes pérdidas económicas y de producción, ya que actualmente no hay vacunas autorizadas disponibles comercialmente3.

ASFV is the only member of the genus Asfivirus of the family Asfarviridae10,11,12, (2020)." href="/articles/s41598-023-36788-9#ref-CR13" id="ref-link-section-d8432881e574"> 13. Su genoma de ADN lineal de doble cadena varía entre 170 y 193 kpb de tamaño y contiene de 150 a 167 marcos de lectura abiertos que codifican proteínas predichas14,15,16. Se ha confirmado la existencia de 134 proteínas virales, pero para muchas de ellas las funciones aún se desconocen o sólo pueden predecirse basándose en homologías de secuencia17,18,19,20,21. Las partículas de VPPA contienen aproximadamente 82 proteínas virales, tienen un tamaño de aproximadamente 250 nm y están multicapa. Comprenden una membrana lipídica externa, una cápside externa icosaédrica, una membrana lipídica interna, una cápside interna, una cubierta central proteica gruesa y un nucleoide que contiene el genoma18,19,22,23.

Las partículas de VPPA ingresan a su célula huésped a través de endocitosis mediada por dinamina y clatrina24,25 o mediante macropinocitosis26,27. Una vez que las partículas de ASFV se han internalizado, circulan a través de toda la vía endolisosomal. Directamente después de la infección pueden detectarse en endosomas o macropinosomas tempranos mediante microscopía electrónica y mediante colocalización de proteínas virales con marcadores endosómicos específicos (EEA1 y Rab5)26. En momentos posteriores, el VPPA se encuentra en endosomas tardíos o lisosomas colocalizando con CD63, Rab7, Lamp1 y catepsina26,28. Durante este transporte, las partículas de ASFV sufren cambios estructurales extensos que resultan en viriones que carecen de membranas externas y cápsides externas dentro de endosomas tardíos multivesiculares. La envoltura interna expuesta de las partículas del VPPA luego se fusiona con la membrana endosómica, lo que da como resultado la liberación de partículas centrales desnudas en el citoplasma26. Después de un paso de iniciación breve y poco comprendido dentro del núcleo, la replicación del ADN viral y la morfogénesis de las partículas virales tienen lugar dentro del citoplasma en las fábricas de virus perinucleares adyacentes al centro organizador de microtúbulos29. Para la formación de partículas de virus de progenie, se adquieren membranas derivadas del retículo endoplásmico (RE) y se ensamblan viriones intracelulares que consisten en el genoma que contiene el núcleo interno, la cápside interna, la envoltura interna y la cápside externa30,31,32,33. Estos viriones intracelulares luego son transportados a lo largo de microtúbulos hasta la periferia celular y adquieren su membrana lipídica externa al brotar de la membrana plasmática34,35,36. Tanto los viriones intracelulares como los viriones con doble envoltura son infecciosos32.

Como patógeno intracelular obligado, el VPPA depende del metabolismo de la célula huésped y de las proteínas para su replicación. El proceso de entrada del VPPA, por ejemplo, depende de la temperatura, la energía y el colesterol 37,38. Requiere la actividad de dinamina, Rac1, Pak1, Rab7, membranas endosómicas con fosfoinosítidos sintetizados por fosfatidilinositol quinasas (PI3K o PIKfyve) y la acidificación de los endosomas25,26,27,28,39,40,41. Además, se ha demostrado que la anulación de la proteína endosómica Niemann Pick C1 (NPC1) o la proteína de membrana lisosomal 1 (Lamp-1), inhibía parcialmente la infección por PPA. Como no se logró una inhibición completa, se especuló que proteínas endosómicas adicionales podrían desempeñar un papel durante este paso de la replicación del ASFV42.

La tecnología CRISPR/Cas9 ofrece métodos para identificar interacciones huésped-patógeno en enfoques imparciales de alto rendimiento43. En el pasado, esta tecnología ya se utilizaba para identificar factores del huésped relevantes para la replicación, por ejemplo, del virus de la influenza, flavivirus, norovirus, virus de Schmallenberg, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis C y virus de la encefalitis japonesa44,45,46,47,48,49 ,50,51. Además, utilizando una biblioteca CRISPR/Cas9 basada en lentivirus recientemente desarrollada y dirigida al genoma porcino (SsCRISPRko.v1), se identificó un nuevo factor del huésped necesario para la replicación del virus de la pseudorrabia alfaherpesvirus porcino (PrV)52.

En este estudio, se utilizó la biblioteca de ARN de guía única (sgRNA) desactivada por CRISPR, que se dirige a todos los genes anotados del genoma porcino (Sus scrofa), para una detección de todo el genoma a fin de identificar factores celulares que son relevantes para la replicación del virus de la peste porcina africana. Nuestros estudios descubrieron que la eliminación de cinco factores de expresión y proteínas de membrana del complejo principal de histocompatibilidad II (MHC II), también llamado complejo de antígeno leucocitario porcino II (SLA II), casi anula la infección reproductiva por PPA. En particular, se descubrió que la proteína heterodimérica no clásica MHC II SLA-DM era crucial para la replicación del ASFV.

Para identificar los genes del huésped y sus respectivos productos proteicos necesarios para la replicación del VPPA en células porcinas cultivadas, se realizó una detección CRISPR/Cas9 de todo el genoma con la biblioteca knockout de CRISPR/Cas9 porcina SsCRISPRko.v1, que se describió y caracterizó previamente52. La biblioteca codificó 83.381 sgRNA que abarcan 1.001 sgRNA de control no dirigidos y 82.380 sgRNA específicos dirigidos a 20.598 genes porcinos con tres o cuatro sgRNA por gen. Las secuencias de sgRNA se clonaron en el vector lentiCRISPRv2, que también proporciona un casete de expresión para Cas9 y un gen de resistencia a puromicina para la selección.

Esta biblioteca se empaquetó en partículas de lentivirus defectuosas que luego se usaron para transducir células de pulmón de jabalí (WSL) con muchos pases, que respaldan la replicación eficiente de muchos aislados de VPPA nativos o adaptados53,54. Para garantizar la integración de un solo gen de sgRNA en el genoma de una sola célula, se eligió una multiplicidad de transducción (MOT) baja de 0,3. Las células resistentes a la puromicina que supuestamente expresaban Cas9 y sgRNA individuales se expandieron durante dos semanas. En ese punto, se almacenaron aproximadamente 6 × 107 células del número total de aproximadamente 4 × 108 células por experimento como controles no infectados para la preparación de ADN. Las células restantes se volvieron a sembrar y se infectaron con ASFV Kenya 1033 ΔCD2v dsRed55,56 recombinante de genotipo IX con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,3 o 0,5. El marcador de expresión fluorescente facilitó la detección de una infección exitosa. Se detectó un efecto citopático progresivo (CPE) a partir de las 48 h después de la infección y después de aprox. de cuatro a cinco semanas se hicieron visibles colonias de células que se originaban a partir de células individuales supervivientes. Estas células se agruparon en dos subconjuntos. Partes de estos grupos se guardaron como "supervivientes 1-1" y "supervivientes 1-2" para la preparación del ADN. Las demás partes se volvieron a sembrar y a infectar y después de aprox. durante tres semanas se pudieron recolectar los 'supervivientes 2-1' y los 'supervivientes 2-2'. La siembra y la infección de las células se repitieron cuatro veces para asegurar la exposición de todas las células al virus. Las infecciones repetidas fueron necesarias, ya que se observó que ASFV Kenya, aunque inducía un CPE muy pronunciado en las células WSL, no siempre podía lisar todas las células de control no transducidas durante una ronda de replicación. Para excluir aún más los falsos resultados de las células que sobrevivieron accidentalmente, el procedimiento de detección se realizó no sólo con dos subconjuntos de células, sino también en dos experimentos independientes.

Para cada cribado, se aisló en paralelo el ADN del control (células antes de la infección) y de los supervivientes (células después de la infección) de los dos subconjuntos y las regiones del gen sgRNA integrado se amplificaron en tres PCR secuenciales con cebadores adecuados (Tabla complementaria S1 ) para la secuenciación de Ion Torrent. Los datos de secuenciación se analizaron utilizando el software del algoritmo MAGeCK, que prueba si la abundancia de genes de sgRNA difiere significativamente entre las células tratadas (sobrevivientes) y los controles, e identifica secuencias de sgRNA enriquecidas dirigidas a loci genómicos específicos con el cálculo de la agregación de clasificación robusta (RRA)57.

Con este análisis, los sgRNA dirigidos a SLA-DMB, LOC100736732, RFXAP, SLA-DMA, LOC106509697, RFXANK y LOC100624181 se encontraron con puntuaciones RRA más bajas (es decir, más elevadas) entre los diez mejores resultados de los genes seleccionados positivamente en los cuatro subconjuntos de las dos pantallas (Fig. 1a, b, Tabla complementaria S2). Para todos estos genes, se encontró elevado más de un sgRNA específico en el conjunto de células supervivientes (Tablas complementarias S2 y S3). Además, el gen CCZ1 de los diez mejores resultados de las pantallas se identificó en tres subconjuntos, mientras que los genes LOC102165390, TMEM30A y VPS33A se encontraron en una de las pantallas, y los genes MARCO, LYPD4 y VPS18 estaban en el primero. diez aciertos en solo uno de los subconjuntos (Fig. 1a, b, Tablas complementarias S2 y S3). Los productos proteicos de la mayoría de estos últimos genes están implicados en las vías de endocitosis y/o autofagia, y se analizarán más a fondo en estudios futuros.

Las pruebas de eliminación de CRISPR/Cas9 en todo el genoma identificaron moléculas de la vía MHC II como relevantes para la replicación del virus de la peste porcina africana. (a) Diagramas de puntuaciones robustas de agregación de rangos (RRA) calculadas por el software del algoritmo MAGeCK de cuatro análisis separados determinados en dos pantallas independientes. El contenido de sgRNA de las células de control se comparó con la abundancia de sgRNA de las células que sobrevivieron a cuatro infecciones posteriores por PPA. ( b ) Puntuaciones medias (-) y RRA únicas de los aciertos de genes individuales en los cuatro análisis diferentes. Los puntos de color azul oscuro representan sgRNA frente a los genes indicados (eje x) que se encuentran en 4/4 subconjuntos. Los puntos de color azul claro medio representan los sgRNA contra el gen CCZ1 que se encontraron en 3/4 subconjuntos. Los puntos de color azul claro muestran sgRNA que solo se encontraron en los 2 subconjuntos de cualquiera de las pantallas realizadas. (c) Esquema de un locus del gen MHC II (por ejemplo, para SLA-DMA o SLA-DMB) con el módulo SXY regulador específico del MHC clase II y factores de transcripción específicos. Las proteínas que se identificaron como factor celular crucial para la infección por ASFV en la pantalla de desactivación CRISPR/Cas9 de todo el genoma se muestran en azul.

Este estudio se centra en el papel de los genes del huésped que se identificaron en los cuatro subconjuntos con puntuaciones muy bajas (SLA-DMB, LOC100736732, RFXAP, SLA-DMA, LOC106509697, RFXANK y LOC100624181). Sorprendentemente, todos ellos están relacionados con el complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC II/SLA II) (Fig. 1c). RFXANK codifica la proteína que contiene anquirina asociada al factor regulador X (RFXANK), y RFXAP codifica la proteína asociada al factor X regulador (RFXAP). RFXANK, RFXAP y el factor regulador X 5 (RFX5) se ensamblan y se unen a la caja X del módulo SXY de los promotores del gen MHC II (Fig. 1c). Junto con otros factores actúan como plataforma de aterrizaje para el transactivador MHC clase II (CIITA)58. CIITA se identificó por sgRNA elevados contra LOC100736732, LOC106509697 y LOC100624181. RFXAP, RFXANK y CIITA son muy importantes para la actividad transcripcional de los promotores del MHC clase II58. Por último, en ambos cribados se identificaron los genes SLA-DMA y SLA-DMB que codifican las cadenas alfa y beta del antígeno leucocitario porcino de clase II no clásico DM (SLA-DM), y se transcriben con la ayuda de lo anterior. -factores mencionados. En resumen, varias líneas de evidencia señalan que la vía MHC II es un factor del huésped muy relevante para la replicación del ASFV.

Para verificar la importancia de la vía de expresión y presentación del MHC II para el ciclo de replicación del VPPA, se introdujeron desactivaciones genéticas específicas en un clon de célula única recién aislado de la línea celular WSL. Se utilizó un clon de células WSL para minimizar el riesgo de que los resultados pudieran verse afectados por diferencias genéticas inherentes. Para la desactivación dirigida se utilizaron los genes que codifican la molécula no clásica del MHC II, SLA-DM, SLA-DMA y SLA-DMB, así como dos genes importantes para la transcripción del MHC II, RFXAP y CIITA (LOC100736732). seleccionado.

Para la eliminación, se seleccionó una de las cuatro secuencias de sgRNA de la biblioteca de cerdos (Figura complementaria S1, azul oscuro; Tabla complementaria S4) y se clonó en el vector de doble expresión de sgRNA y Cas9 pX330A-1 × 4neoRA. Las células WSL se transfectaron con los plásmidos obtenidos, se diluyeron en serie y se seleccionaron para determinar la resistencia a G418. Se propagaron clones de células individuales resistentes y se comprobó la expresión de Cas9 mediante inmunotransferencia. Luego se aisló el ADN de las células positivas para Cas9 y se verificó la integración correcta del gen sgRNA mediante amplificación por PCR y secuenciación con cebadores adecuados (Tabla complementaria S5). Además, se realizaron análisis de PCR con cebadores específicos para las regiones genéticas objetivo de SLA-DMA, SLA-DMB, RFXAP y CIITA (Tabla complementaria S5). Después del análisis de secuencia de los productos de amplificación, clones de células WSL knockout (WSLKO) con inserciones o eliminaciones de nucleótidos perjudiciales (INDEL) en SLA-DMA (clones 11, 12, 16), SLA-DMB (clones 9, 16, 18), CIITA (clones 1, 4, 8) o RFXAP (clones 6, 8) (Figura complementaria S2). El clon celular WSL SLA-DMAKO (11) mostró una inserción de 823 nt que contiene codones de parada en todos los marcos de lectura, que se deriva del vector de transferencia pX330A-1×4neoRA. Los clones WSL SLA-DMAKO (12) y (16), así como WSL SLA-DMBKO (9), poseen eliminaciones de 1 nt que provocan cambios de marco y codones de parada prematuros (Figura complementaria S2). Por el contrario, WSL SLA-DMBKO (16) y (18) exhiben una inserción idéntica de 1 nt (T) que crea directamente un codón de parada (TGA). Los clones celulares WSL CIITAKO (1), (4) y (8) mostraron eliminaciones de 1, 5 y 23 nucleótidos, respectivamente, lo que provocó cambios de marco y terminación prematura. WSL RFXAPKO (6) exhibió una inserción de 1 nt (C), lo que conduce a un codón de terminación aguas abajo (TGA), y en WSL RFXAPKO (8) se mostró una inserción que contiene un codón de parada de 140 nt del vector pX330A-1×4neoRA. encontrado (Figura complementaria S2). Sorprendentemente, con todos los clones celulares seleccionados solo se obtuvieron productos de PCR únicos que exhibían secuencias inequívocas de los genes mutados, lo que indica cambios bialélicos idénticos o grandes deleciones en los otros alelos, que incluían los sitios de unión del cebador. Nunca se observaron secuencias de tipo salvaje de las regiones diana de sgRNA.

Estudios anteriores indicaron que las células WSL expresan la proteína MHC II SLA-DR en su superficie54. Esto se verificó mediante análisis de inmunofluorescencia indirecta (IF) de células no permeabilizadas utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb) específico de SLA-DR (Fig. 2a). Mientras que SLA-DR fue detectable en la superficie de las células WSL parentales y las células knockout WSL SLA-DMAKO y WSL SLA-DMBKO, no fue visible en las células knockout RFXAP y CIITA (Fig. 2a). Esto confirmó que RFXAP y CIITA son factores esenciales para la transcripción del MHC II.

Las células parentales WSL y WSL knockout difieren en la expresión de proteínas MHC II. ( a ) Análisis de inmunofluorescencia indirecta de la expresión en la superficie celular de SLA-DR en clones celulares WSL, WSL SLA-DMAKO, WSL SLA-DMBKO, WSL CIITAKO y WSL RFXAPKO. Barra: 30 µm. (b) Análisis por espectrometría de masas de los niveles de expresión cuantitativa del gen constitutivo α-tubulina (TUBA4A-ENSSSCG00000016216), de genes de la vía MHC II (SLA-DRA-ENSSSCG00000001453, SLA-DRB1-ENSSSCG00000001455, SLA-DQA-ENSSSCG00000001456, SLA -DQB-ENSSSCG00000001457), y de la vía MHC I (SLA-8-ENSSSCG00000001231, HLA-E-ENSSSCG00000001229) en WSL y células knockout indicadas basadas en cuantificación sin etiquetas (LFQ). Los datos representan medias de tres réplicas. Los paneles grises indican que no se detectaron las proteínas respectivas. (c) Análisis cuantitativo comparativo de los niveles de expresión de proteínas en WSL y clones de células WSLKO individuales. Las proteínas se indican con puntos. Los puntos negros representan proteínas implicadas en el procesamiento y la presentación de antígenos. En la medida en que se detectan, las proteínas SLA I/II que se muestran en b están resaltadas en rojo.

Para la caracterización de las eliminaciones a nivel de proteoma, el contenido de proteínas de las líneas celulares eliminadas se analizó mediante espectrometría de masas (MS) (Fig. 2b, c). De las 5495 proteínas que se identificaron y cuantificaron, 4874 se detectaron en todos los clones celulares (Tabla complementaria S6). La composición proteica de todos los clones celulares fue muy similar, como lo indica la falta de una agrupación clara de las réplicas después del análisis de componentes principales (PCA) (Figura complementaria S3). Desafortunadamente, la expresión de SLA-DM no fue detectable en los análisis de MS, ni en células knockout ni en células WSL normales. Sin embargo, la eliminación única de RFXAP o CIITA suprimió la síntesis de otras proteínas MHC II identificadas (SLA-DR, SLA-DQ) por debajo de los niveles de detección y también afectó la expresión de MHC I (SLA-8, HLA-E), mientras que la expresión de estas proteínas no se vio afectada en las células WSL SLA-DMAKO y WSL SLA-DMBKO (Fig. 2b, c).

Antes de probar si el VPPA es capaz de replicarse en células que carecen de moléculas de la vía MHC II, se deben excluir los efectos secundarios inespecíficos de estos knockouts sobre la viabilidad y la susceptibilidad a otras infecciones virales. Para este propósito, WSL parental, WSL SLA-DMAKO (clones 11, 12, 16), WSL SLA-DMBKO (clones 9, 16, 18), WSL CIITAKO (clones 1, 4, 8) y WSL RFXAPKO (clones 6 , 8) las células se infectaron con un mutante que expresa GFP del virus de la pseudorrabia alfaherpesvirus porcino (PrV). Los estudios revelaron que ni la eficiencia de la siembra en placa, ni el tamaño de las placas, ni los títulos de virus de la progenie de PrV diferían significativamente entre las células WSL parentales y las líneas celulares knockout probadas (Figura complementaria S4). Esto demostró que las células knockout son per se adecuadas para la propagación de un virus porcino.

Para la infección de las células por ASFV se utilizaron dos cepas de virus diferentes. Además de la cepa parental de genotipo IX del virus recombinante utilizada para la selección de bibliotecas (ASFV Kenya 1033), también se incluyó una variante del virus panzoótico actual de genotipo II (ASFV Armenia 2008). Se infectaron clones de células WSL parentales y knockout con diluciones en serie de ambos virus. Después de 4 días en medio semisólido, las células se fijaron y las células infectadas y las placas de virus se visualizaron mediante detección IF de la proteína p72 de la cápsida del VPPA. La microscopía de fluorescencia reveló que ambas cepas pudieron infectar considerablemente más células WSL parentales que cualquiera de las células knockout (Fig. 3a). Las eficiencias de colocación calculadas en todas las células WSLKO probadas se redujeron significativamente a <4% en comparación con las células WSL (Fig. 3b). Además, las áreas de placa se redujeron significativamente a menos del 14% para ASFV Armenia y menos del 10% para ASFV Kenya en células WSLKO en comparación con los tamaños de placa del virus respectivo en la línea celular parental (Fig. 3c). También se observó un deterioro grave de la replicación del ASFV en estudios de crecimiento de múltiples pasos (MOI 0,02). Mientras que ASFV Armenia se replicó en células WSL a títulos máximos de 1,8 × 107 UFP/ml a las 168 h después de la infección (pi), los títulos en células knockout oscilaron entre 1,2 × 104 UFP/ml en WSL SLA-DMBKO (18) y 3,8 × 104 UFP/ml en WSL RFXAPKO (8) (Fig. 3d). El título final de ASFV Kenya en células WSL fue de 2,0 × 107 UFP/ml, mientras que en las células knockout los títulos oscilaron entre 1,2 × 105 UFP/ml en WSL SLA-DMAKO (16) y 1,23 × 106 UFP/ml en WSL RFXAPKO ( 8) celdas (Fig. 3d). Por lo tanto, los títulos de ASFV Armenia se redujeron en 3 logs, y los títulos de ASFV Kenya se redujeron en al menos 1,5 logs en la eliminación de WSL en comparación con las células parentales. Además, era evidente que la replicación productiva del ASFV Armenia en células knockout alcanzó una meseta a las 72 h pi, mientras que los títulos de ASFV Kenya aumentaron hasta las 120 h pi. Esto podría indicar que las pocas células knockout infectadas con éxito con ASFV Kenya son capaces de producir más virus infeccioso durante un período de tiempo más largo que las células infectadas con ASFV Armenia, lo que estaría en línea con títulos ligeramente más altos de ASFV Kenya observados en células WSL normales.

La replicación del ASFV en células knockout de WSL está alterada. ( a ) Visualización de células WSL y WSLKO infectadas por ASFV Armenia o ASFV Kenya (verde) y ácidos nucleicos (azul) mediante tinción por inmunofluorescencia. Imágenes representativas de los clones celulares indicados infectados con diferentes diluciones de virus (10–1 a 10–3) para ilustrar la eficiencia de las placas y los tamaños de las placas. Barra: 100 µm. (b) La eficiencia de la siembra de ASFV Armenia y ASFV Kenya se calculó contando células o placas infectadas con ASFV en tres experimentos independientes (n = 3). Se muestran los títulos aparentes relativos medios (%) en comparación con los de las células WSL y las desviaciones estándar. Las diferencias significativas se calcularon mediante ANOVA unidireccional ordinario seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. **** = p < 0,0001. (c) Para la determinación de los tamaños de las placas, se midieron áreas de cincuenta placas por línea celular de tres experimentos independientes (n = 150), y se muestran las áreas relativas medias (%) en comparación con las células WSL, incluidas las desviaciones estándar. Las diferencias significativas se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunn. **** = p < 0,0001. ( d ) Análisis de la curva de crecimiento de varios pasos (MOI 0,02) de ASFV Armenia o Kenia en células WSL y WSLKO. Se muestran los resultados medios de tres experimentos independientes (n = 3) con desviaciones estándar.

Además del análisis de la progenie de virus infecciosos en lisados ​​​​de células infectadas, también se investigó la replicación del ADN viral (Fig. 4). Con este fin, se infectaron células WSL parentales y clones de células WSLKO seleccionadas con ASFV Armenia a una MOI de 3 y se recolectaron a las 0, 2, 4, 8, 16 y 32 h pi. Se preparó ADN total y se usó para determinar los números de copias del genoma de ASFV. mediante reacciones dúplex TaqMan qPCR para la detección del gen viral B646L y el gen de β-actina de la célula huésped como control interno (Fig. 4). Las sondas específicas de B646L mostraron cantidades de ADN moderadamente aumentadas después de 4 h y una fase de replicación exponencial hasta las 8 h pi en células WSL parentales. En momentos posteriores, la replicación del ADN viral se ralentizó y dio como resultado 2,8 × 107 copias del genoma en las muestras analizadas (que contienen ADN de aproximadamente 1 × 104 células) a las 32 h pi. Se observó un inicio retrasado de la replicación del ADN en todos los clones de células WSLKO, lo que resultó en un aumento moderado del número de copias del genoma entre 8 h pi y 16 h pi Desde las 16 h pi hasta el final del experimento, la cantidad de ADN viral permaneció casi constante y osciló entre 1,2 × 105 genomas de PPA en células SLA-DMBKO (9) y 6,8 × 105 genomas de PPA en células RFXAPKO (8). Dado que el número de copias del genoma del ASFV fue considerablemente menor en todas las células WSLKO analizadas en todos los puntos temporales analizados, las proteínas del huésped eliminadas son obviamente importantes para un paso que precede al inicio de la replicación del genoma viral.

La replicación del ADN del VPPA se inhibe en las células knockout de WSL. Se infectaron células WSL y WSLKO parentales con ASFV Armenia a una MOI de 3 y, después de los tiempos indicados, se cuantificaron las cantidades de ADN de ASFV mediante qPCR en tiempo real dirigida al gen viral B646L. Los números de copias del genoma se determinaron utilizando estándares de plásmidos. Los gráficos representan medias de dos réplicas biológicas con desviaciones estándar.

Para dilucidar aún más qué pasos del ciclo de replicación del virus podrían bloquearse después de la eliminación de los genes relacionados con el MHC II, se analizaron células WSL, WSL SLA-DMAKO (11) y WSL CIITAKO (1) mediante microscopía electrónica (EM) 16 h después de la infección. con ASFV Armenia en un MOI de 5 (Fig. 5). Las partículas de virus extracelulares maduras, las partículas intracelulares y las fábricas de virus solo se detectaron en las células WSL parentales, mientras que no se encontraron rastros de replicación del ASFV en ninguna de las células knockout. Estos resultados también indican una función de las proteínas de la célula huésped inactivadas en los pasos iniciales de la replicación del virus, que está en línea con la eficiencia de siembra y el número de copias del genoma sustancialmente reducidos del VPPA en las células WSLKO.

Las partículas del virus de la progenie del VPPA se detectan en células WSL parentales infectadas, pero no en células knockout. (a – d) Las células WSL, (e) WSL SLA-DMAKO y (f) WSL CIITAKO se fijaron y analizaron mediante microscopía electrónica 16 h después de la infección con ASFV Armenia a una MOI de 5. Fábricas de virus (flecha), intracelular ( *) y se indican las partículas de virus extracelulares (#). Las barras representan 1 µm (a, e, f) o 200 nm (b, c, d).

Para probar si la inhibición observada de la replicación del ASFV en células knockout para SLA-DM se debe en realidad a la ausencia de las proteínas respectivas, las células WSL SLA-DMAKO (11) y SLA-DMBKO (9) se transformaron de manera estable con SLA-DMA o SLA. -Casetes de expresión DMB, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de los marcos de lectura abiertos se optimizaron con codones y se modificaron en las regiones objetivo del sgRNA mediante la introducción de alteraciones silenciosas de nucleótidos para excluir la inactivación de los transgenes por la maquinaria CRISPR/Cas9 aún integrada de las células knockout (Figura complementaria S5). . Los genes sintéticos se clonaron con y sin etiquetas (StrepII, Myc) en vectores de expresión de lentivirus dando como resultado pLV-SLA-DMA, pLV-SLA-DMA-Myc, pLV-SLA-DMA-Strep, pLV-SLA-DMB y pLV. -SLA-DMB-Myc, y una construcción de expresión de GFP (pLV-GFP) que sirve como control. Las células WSL parentales se transdujeron con todos los vectores generados; Se transdujeron células SLA-DMAKO (11) con pLV-SLA-DMA, pLV-SLA-DMA-Myc, pLV-SLA-DMA-Strep o pLV-GFP, y células SLA-DMBKO (9) con pLV-SLA- Se seleccionaron DMB, pLV-SLA-DMB-Myc o pLV-GFP y células transformadas de forma estable usando medio que contenía puromicina. A diferencia de las células WSL parentales y knockout, las proteínas marcadas de los tamaños esperados fueron detectables mediante transferencia Western en las células WSL knockout/knockin (WSLKO/KI) (Fig. 6). Desafortunadamente, las proteínas SLA-DMA y -DMB no marcadas no fueron reconocidas por los anticuerpos disponibles generados contra el antígeno leucocitario humano (HLA) -DMA y HLA-DMB. Sin embargo, estas líneas celulares se incluyeron en el análisis de la infección por ASFV, ya que las etiquetas agregadas en el extremo C-terminal podrían afectar la maduración o la formación de complejos heterodiméricos entre las cadenas alfa o beta endógenas codificadas por el transgén y no afectadas de SLA-DM.

Las células WSL knockout/knockin expresan transgenes MHC II. Se utilizaron lisados ​​de (a) células WSL SLA-DMAKO y (b) células WSL que expresan transgenes SLA-DMA o GFP indicados, o lisados ​​de (c) células SLA-DMBKO y (d) células WSL que expresan transgenes SLA-DMB o GFP indicados. separados por SDS-PAGE, transferidos a membranas de nitrocelulosa y sondados con anticuerpos contra las proteínas o etiquetas de proteínas indicadas. Las masas moleculares de las proteínas marcadoras (en kDa) se indican a la izquierda. Las transferencias originales se presentan en las figuras complementarias 6a – d.

En células SLA-DMAKO (11) transducidas, la eficiencia de siembra de ASFV Armenia y Kenia aumentó a aproximadamente 77% y 86%, respectivamente, de los títulos en células WSL parentales después de la reintroducción de SLA-DMA auténtico (SLA-DMAKO-DMAKI) (Fig. .7a). En células SLA-DMAKO-DMA-MycKI se alcanzaron el 42% (Armenia) y el 50% (Kenia), y en las células SLA-DMAKO-DMA-StrepKI el 79% (Armenia) y el 90% (Kenia) de los títulos originales. En células WSL SLA-DMBKO-DMBKI se observaron eficiencias de siembra del 77% (Armenia) y 94% (Kenia), y en células SLA-DMBKO-DMB-MycKI se observaron eficiencias de siembra del 63% (Armenia) y 56% (Kenia) ( Figura 7a). En la mayoría de los casos, los títulos de virus aparentes en diferentes células WSLKO/KI no fueron significativamente más bajos que en las células WSL parentales (Fig. 7a). Por lo tanto, las etiquetas agregadas obviamente no afectaron (StrepII) o solo afectaron marginalmente (Myc) la función propuesta de SLA-DM para la replicación del ASFV. En Información complementaria se muestran análisis estadísticos adicionales de las diferencias observadas entre las eficiencias de recubrimiento en clones de células knockout, knockin y knockout/knockin.

La expresión del transgén MHC II en células knockout/knockin de WSL restauró la replicación del ASFV. ( a, b ) Para determinar la eficiencia del recubrimiento y el tamaño de la placa, las células WSL, WSLKO y WSLKO / KI infectadas con ASFV Armenia o ASFV Kenia se visualizaron mediante tinción por inmunofluorescencia. (a) La eficiencia de la siembra de ASFV Armenia y ASFV Kenya se calculó contando células o placas infectadas con ASFV en tres experimentos independientes (n = 6). Se muestran los títulos medios relativos (%) en comparación con los de las células WSL y las desviaciones estándar. Las diferencias significativas se calcularon mediante ANOVA unidireccional ordinario seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. * = p < 0,05, **** = p < 0,0001, ns = no significativo. (b) Para la determinación de los tamaños de las placas, se midieron áreas de cincuenta placas por línea celular de tres experimentos independientes (n = 150) y se muestran los tamaños relativos medios (%) en comparación con las células WSL, incluidas las desviaciones estándar. Las diferencias significativas se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunn. *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001, ns = no significativo. ( c – e ) Análisis de crecimiento de múltiples pasos (MOI 0.02) de ASFV Armenia y Kenia en células WSL (c) WSL, (d) WSL-DMAKO y (e) WSL-DMBKO transducidas con lentivirus no tratados y que expresan transgenes. Se muestran los resultados medios de dos experimentos independientes con dos réplicas (n = 4) y desviaciones estándar.

La transducción estable de células WSL SLA-DMAKO y SLA-DMBKO con casetes de expresión para las proteínas marcadas o no marcadas correspondientes también restauró la propagación de célula a célula del VPPA de Armenia y del VPPA de Kenia. En todos los casos, las placas en diferentes células WSLKO/KI mostraron tamaños similares o incluso mayores que los detectados en las células WSL parentales (Fig. 7b, Fig. Suplementaria S6). Los análisis estadísticos de las diferencias en el tamaño de la placa entre los clones celulares individuales se muestran en las tablas complementarias S10 y S11.

En consonancia con esto, los estudios de cinética de crecimiento revelaron que en células WSLKO/KI los títulos de virus de la progenie de ASFV Armenia y Kenia aumentaron en aprox. 2,5 y 1,5 log, respectivamente, en comparación con los de las células parentales (Fig. 7c-e), y los títulos de virus finales fueron nuevamente similares a los de las células WSL originales. En conjunto, estos resultados muestran que los efectos nocivos de la desactivación de SLA-DMA/B sobre la susceptibilidad a la infección por ASFV pueden revertirse por completo mediante la expresión de los transgenes correspondientes, lo que demuestra un papel específico crucial de SLA-DM en la replicación de ASFV.

Como patógeno viral intracelular, el VPPA, a pesar de su complejo genoma y proteoma, todavía requiere muchos factores del huésped para su propagación. Utilizando una prueba de eliminación de CRISPR/Cas9 en todo el genoma en una línea celular porcina susceptible (WSL), identificamos los genes RFXAP, RFXANK, SLA-DMA, SLA-DMB y los genes que codifican CIITA (LOC100736732, LOC106509697 y LOC100624181) como principales candidatos. importante para la replicación del ASFV. Las proteínas codificadas por estos genes forman parte de la vía de expresión y presentación del MHC II (SLA II)58. La inactivación dirigida de RFXAP, CIITA, SLA-DMA y SLA-DMB inhibió sustancialmente la replicación de las cepas de ASFV de genotipo II y IX, incluido el genotipo actual del virus panzoótico, lo que confirmó la importancia de ciertas moléculas de MHC II para la replicación de ASFV in vitro. Además, la reconstitución de SLA-DMA o SLA-DMB en las células knockout correspondientes restauró completamente su capacidad de replicación del ASFV y apunta a un papel específico crucial de la molécula SLA-DM del MHC II durante el ciclo de vida viral.

El complejo MHC II está altamente conservado en los vertebrados y se denomina SLA II en cerdos y HLA II en humanos. Los cerdos poseen cuatro moléculas MHC II, SLA-DR, SLA-DQ, SLA-DO y SLA-DM59. SLA-DR y -DQ son glicoproteínas transmembrana de la superficie celular del MHC II clásicas que presentan péptidos exógenos al receptor de antígeno de las células T auxiliares CD4+, mientras que SLA-DM y -DO se denominan moléculas MHC II no clásicas. En los seres humanos, participan en la regulación de la carga de péptidos antigénicos en las moléculas clásicas del MHC de clase II. Todas las proteínas MHC II son heterodímeros que están compuestos de cadenas α y β, y en las proteínas MHC II clásicas los dominios a1 y b1 forman el surco de unión a péptidos. Para la vía de síntesis y presentación humana se ha descrito60 que las subunidades α y β del MHC II clásico se sintetizan en el RE, donde se ensamblan con la chaperona específica CD74/cadena invariante (li). El li promueve el plegamiento del MHC II, previene la unión prematura de péptidos y clasifica las moléculas del MHC II en compartimentos endosómicos tardíos, ya sea directamente desde la red trans-Golgi o mediante reternalización desde la superficie celular. El entorno ácido de los endosomas degrada principalmente li, pero deja un fragmento de li específico, el péptido asociado a cadena invariante de clase II (CLIP), dentro del surco de unión del MHC II. La liberación de CLIP es inducida por la molécula DM del MHC II no clásica mediante la promoción de un cambio conformacional, mediante el cual las proteínas del MHC II clásicas se cargan con péptidos antigénicos de mayor afinidad. Esos péptidos resultan de antígenos que fueron internalizados por endocitosis, fagocitosis o micropinocitosis mediada por clatrina.

El VPPA ingresa a sus células huésped mediante endocitosis o macropinocitosis mediada por clatrina. Al igual que el MHC II DM, que se dirige a los endosomas tardíos a través de un motivo de tirosina60, el VPPA también se dirige a los endosomas tardíos durante la entrada24,25,26,27,28. Por lo tanto, los endosomas tardíos representan un compartimento celular donde las moléculas MHC II DM (SLA-DM) y las partículas entrantes de ASFV se acercan. Recientemente se ha descubierto que las proteínas endosómicas NCP1 y LAMP-1/-2 interactúan con las supuestas proteínas de fusión del ASFV pE258R o pE199L, respectivamente. Además, la eliminación de NCP1 inducida por CRISPR/Cas9 condujo a una retención de partículas de ASFV dentro de los endosomas tardíos. Además, se observó una reducción de las células infectadas con el VPPA y una disminución de la replicación viral. Como la infección por PPA solo se inhibía parcialmente, se planteó la hipótesis de que el virus podría utilizar factores endosómicos alternativos del huésped42. En nuestro estudio, las células knockout SLA-DMA y SLA-DMB mostraron un defecto grave en la susceptibilidad a la infección por ASFV y la posterior replicación del ADN y del virus. Este efecto podría revertirse mediante la reintroducción de las respectivas subunidades SLA-DM, lo que indica que SLA-DM podría ser importante para la entrada del ASFV, por ejemplo, para un descubierto eficiente y la liberación de partículas centrales de los endosomas tardíos. Lamentablemente, los primeros intentos de localizar el virus de la peste porcina africana en células SLA-DMAKO y CIITAKO inoculadas mediante microscopía electrónica fracasaron y no se pudieron observar acumulaciones de partículas estancadas dentro de los compartimentos endosómicos tardíos, posiblemente debido a su rápida degradación y a su moderado MOI de 5 WSL infecciosos de tipo salvaje. unidades por celda. Sin embargo, la ausencia de fábricas virales y cantidades detectables de partículas de virus de progenie en los análisis de microscopía electrónica de células WSLKO, así como las eficiencias de siembra sustancialmente reducidas y el número de copias del genoma de ASFV en células WSLKO versus células de tipo salvaje parentales indican fuertemente que la infección del MHC II -Las células eliminadas se bloquean muy temprano.

En las pruebas de eliminación de CRISPR/Cas9 de todo el genoma de células WSL resistentes a la infección por ASFV, los sgRNA dirigidos a RFXAP, RFXANK, LOC100736732, LOC106509697 y LOC100624181 también se elevaron significativamente. Estos genes codifican RFXAP, RFXANK y CIITA (LOC100736732, LOC106509697, LOC100624181). Junto con RFX5, estas moléculas participan en la expresión de todos los genes MHC II61,62,63,64,65. Nuestros estudios revelaron que en las células CIITAKO o RFXAPKO, la infección por ASFV se inhibió en un grado similar al de las células knockout que carecen de SLA-DMA o SLA-DMB. A diferencia de las células SLA-DMKO, la expresión de MHC II generalmente se inhibía en células que carecían de genes CIITA o RFXAP funcionales. Esto se demostró mediante análisis IF y MS que no detectaron las moléculas clásicas del MHC II SLA-DR y SLA-DQ, aunque están presentes en las células WSL parentales. Dado que CIITA y RFXAP son reguladores generales de la expresión del MHC II58, es probable que las células knockout correspondientes también carezcan de las moléculas no clásicas del MHC II SLA-DO y SLA-DM que no pudieron detectarse ni cuantificarse con las herramientas disponibles. Aunque no se puede excluir que las proteínas reguladoras CIITA o RFXAP, o SLA-DR, SLA-DQ y SLA-DO también estén directamente implicadas en la infección o replicación del VPPA, parece más probable que SLA-DM sea la única molécula relevante del MHC II. . Esto se sustenta en el hecho de que no se identificaron coincidencias de sgRNA dirigidas a SLA-DR, SLA-DQ o SLA-DO en la pantalla de eliminación de CRISPR/Cas9 realizada. Además, el análisis de citometría de flujo de células susceptibles indicó que la expresión de la molécula clásica del MHC II, SLA-DQ, no es esencial para la infección por PPA66. Por el contrario, una prueba de eliminación de CRISPR/Cas9 para descubrir factores relevantes del huésped para el virus de la influenza A en murciélagos identificó, además de los factores de transcripción del MHC II RFXANK, RFXAP, RFX5 y CIITA, también las moléculas clásicas del MHC II HLA-DRA y HLA-DRB1, y se confirmaron experimentos posteriores. que la molécula HLA-DR del MHC II es un determinante de entrada esencial para los virus de la influenza A en murciélagos46.

Estudios anteriores revelaron que la infección de macrófagos por PPA regula negativamente la expresión de SLA-DMA y SLA-DMB, mientras que la expresión de SLA-DOA/B está regulada positivamente67. Los resultados actuales indican que, además del papel propuesto en la evasión inmune, esta regulación negativa de SLA-DM inducida por el ASFV también podría prevenir la reinfección de las células huésped y, por lo tanto, mejorar la eficiencia de la propagación del virus. La modulación de la respuesta inmune celular mediada por MHC II también se ha descrito para la infección por citomegalovirus humano, donde la proteína viral pUS2 destruye HLA-DMA y -DRA para evitar el reconocimiento por parte de las células T CD4+68.

La expresión de las moléculas del MHC II se encuentra predominantemente en células presentadoras de antígenos (APC) profesionales, como macrófagos, células B y células dendríticas, así como en células epiteliales del timo69,70,71. Además, se ha descrito la expresión de MHC II en diversos endotelios capilares de cerdos72. Al principio pareció sorprendente que se identificaran moléculas de la vía MHC II durante nuestras pruebas de eliminación de CRISPR/Cas9 en células WSL, que son una línea permanente derivada del pulmón de jabalí. Sin embargo, la caracterización previa de las células WSL ya mostró que estas células expresan proteínas que son específicas del linaje de monocitos/macrófagos, incluidas SWC3, CD14, CD169, CD163 y SLA II. Por lo tanto, se ha especulado que las células WSL se derivan del linaje mieloide y podrían representar precursores inmaduros de los macrófagos54. Los monocitos y macrófagos, que pertenecen al grupo de las APC, son las principales células diana del VPPA en su huésped vertebrado73,74. Por lo tanto, en futuros estudios se debería intentar eliminar la expresión de SLA-DM en macrófagos, por ejemplo, con ARNip para verificar si esto afecta la replicación del ASFV también en su célula huésped natural.

Las pruebas de detección de pérdida de función CRISPR/Cas9 son herramientas poderosas para identificar los factores del huésped necesarios para la entrada del virus y para los pasos posteriores de la replicación del virus. Estudios anteriores de este tipo identificaron proteínas celulares que son cruciales para la replicación de virus de la influenza, flavivirus, norovirus, lentivirus, herpesvirus y otros44,45,46,47,48,49,50,51,52. Con los datos presentados aquí pudimos demostrar inequívocamente por primera vez que los componentes del sistema MHC II, en particular la proteína de membrana no clásica SLA-DM, son cruciales para la replicación del ASFV, al menos en cultivo celular. Se requieren más investigaciones para desentrañar en detalle cómo el ASFV utiliza esta molécula de la respuesta inmune celular para su propio beneficio. Además, hay que investigar si SLA-DM podría ser una proteína diana adecuada para el tratamiento antiviral o para el desarrollo de cerdos resistentes al virus de la peste porcina africana.

Las líneas celulares se obtuvieron de la colección de cultivos celulares para medicina veterinaria (CCVM) del Friedrich-Loeffler-Institut (FLI). La línea celular de pulmón de jabalí con muchos pases (WSL-R-HP, #1346; abreviada como WSL) se mantuvo en medio de cultivo celular F12 de Ham (F-12 de Ham, 5,32 g/l; IMDM, 8,80 g/l; NaHCO3, 2,45 g/L; pH 7,2) que se complementó con suero fetal bovino (FCS) al 10%. La clonación de la línea celular se realizó mediante dilución limitante en placas de 96 pocillos. Se propagaron células individuales y se seleccionó y utilizó un clon de células WSL con fenotipo parental para todos los experimentos de inactivación específicos. Una línea celular de riñón de conejo (RK-13, #0237) se mantuvo en Medio Esencial Mínimo (MEM; sal de MEM-Eagle-Hank, 5,32 g/L; sal de Earle MEM, 4,76 g/L; NaHCO3, 1,25 g/L; aminoácidos no esenciales, 1%; Na-piruvato, 0,12 g/L; pH 7,2) suplementado con 10% de FCS. La línea celular de riñón de embrión humano (HEK293Td4.1, n.º 1539) también se mantuvo en MEM suplementado con FCS al 10 %. Todas las células se incubaron a 37 °C y 2,5% de CO2.

Sandra Blome (FLI) proporcionó amablemente ASFV Armenia 2008 (ASFV Armenia), un aislado virulento de genotipo II de ASFV de Armenia55. El virus se adaptó para un crecimiento eficiente en cultivo celular mediante 21 pases seriados en células WSL. El aislado de genotipo IX ASFV Kenya 103355,75 fue amablemente proporcionado por Richard Bishop (Instituto Internacional de Investigación Ganadera, Nairobi, Kenia). Günther M. Keil (FLI) proporcionó amablemente el mutante ASFV Kenya 1033 ΔCD2v dsRed que contiene un casete de expresión del gen indicador en el locus del gen CD2v (EP402R) eliminado55,56. El mutante PrV basado en plásmido PrV-BaΔgGG76 se utilizó como virus de control heterólogo.

Se ha descrito la generación y caracterización de la biblioteca knockout CRISPR porcina (SsCRISPRko.v1)52. Brevemente, para la generación de ARN guía únicos (sgRNA) específicos que se dirigen a genes codificadores de proteínas, se utilizó el ensamblaje del genoma S. scrofa 10.277. Se seleccionaron de tres a cuatro sgRNA para cada gen. En total, la biblioteca CRISPR porcina constaba de 83.381 sgRNA específicos dirigidos a 20.598 genes porcinos y 1.001 controles no dirigidos, clonados en la columna vertebral de pLenti-CRISPRv2 (Addgene #52961).

La detección de eliminación de CRISPR/Cas9 en todo el genoma se realizó como se describió anteriormente52 con ligeras modificaciones como se describe a continuación.

En cinco placas de 20 cm se sembraron 5 x 106 células WSL cada una un día antes de ser transducidas con la biblioteca lentiviral sgRNA, que se produjo de acuerdo con el protocolo de Joung, et al.78, a un MOT de 0,3 en medio que contenía 10 µg/ml de polibreno. Tres días después de la transducción, las células se dividieron en ocho placas a una densidad de 5 x 106 células/placa con un medio que contenía 1,25 µg/ml de puromicina. En el momento de la confluencia, las células transducidas seleccionadas se dividieron nuevamente en un total de 16 placas a una densidad de 5 x 106 células/placa. A los 12 días posteriores a la transducción, se sembraron células en 30 placas a una densidad de 1 x 107 células/placa para la infección al día siguiente. En este momento, se recolectaron, sedimentaron y almacenaron al menos 6 × 107 células como controles a -20 ° C para la extracción de ADN. La infección se realizó con ASFV Kenya 1033 ΔCD2v dsRed a una MOI de 0,3 o 0,5 (dependiendo de las cantidades disponibles de reservas de virus), ya que se había demostrado que esta MOI era necesaria para matar al menos a la mayoría de las células de control WSL infectadas. Las células se comprobaron diariamente para determinar la expresión de marcadores fluorescentes y el efecto citopático, y se añadió o cambió el medio según correspondiera. Para los cambios de medio se incluyó un 20% de medio acondicionado de células WSL no tratadas. Después de aprox. Se tripsinizaron colonias de células en crecimiento de cuatro a cinco semanas de todas las placas y se dividieron en dos subconjuntos combinados. Se almacenaron al menos 2 x 107 células de cada subconjunto a -20 °C para la preparación del ADN. Las células restantes se volvieron a sembrar en placas de cultivo celular y se infectaron como se indicó anteriormente. Las células que sobrevivieron a la segunda infección se recogieron aprox. 20 días después. La recolección de células para la preparación de ADN, la resiembra y la infección se repitió cuatro veces en total. Todo el procedimiento de detección se realizó dos veces, lo que dio como resultado dos conjuntos de células de control no infectadas y ocho poblaciones supervivientes (dos conjuntos por detección).

Para una inactivación fiable del virus, las células sedimentadas se resuspendieron en TEN (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM) suplementado con ARNasa A (500 µg/ml, Serva) y se incubaron durante 1 h a 37 °C. . Después de agregar SDS a una concentración final de 0,3%, las muestras se incubaron más a 75 °C durante 30 minutos, antes de ejecutar el protocolo estándar de lisis y extracción de ADN utilizando tampón sarkosilo, ARNasa A, pronasa, extracción con fenol-cloroformo y etanol. precipitación como se describió anteriormente52.

Para generar bibliotecas de secuenciación se realizaron tres amplificaciones por PCR secuenciales de los ADN extraídos. Primero, se prepararon cuatro reacciones de 50 µl por muestra que contenían 5 µg de ADN, 25 fmol cada uno de cebador directo P5 (ITA2fwd_P5) y cebador inverso P7 (ITA2rev_P7_leCRV) (Tabla complementaria S1) y 3,75 U de ADN polimerasa ExTaq (Clontech). según las especificaciones del fabricante. Las condiciones de incubación fueron las siguientes: 95 °C por 1 min, 28 ciclos de 95 °C por 30 s, 53 °C por 30 s, 72 °C por 1 min, 72 °C por 10 min. Después de la amplificación, se agruparon las cuatro reacciones de PCR de cada muestra y los productos de 155 pb se purificaron en gel utilizando un kit de extracción en gel (Zymo Research). El ADN se eluyó en agua libre de nucleasas y se usaron 200 ng de ADN en una segunda reacción de PCR con los mismos ingredientes que antes pero con 25 fmol cada uno de un cebador directo de código de barras P5 específico de la muestra (por ejemplo, ITA2fwd_ID85_P5both) y un cebador inverso P7. cebador (por ejemplo, ITA2rev_IDxx_P7leCrv2) (Tabla complementaria S1). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 95 °C durante 1 min, 14 ciclos de 95 °C durante 30 s, 57 °C durante 30 s, 72 °C durante 1 min, 72 °C durante 10 min. Los productos de la PCR se purificaron con el kit de eliminación de nucleótidos QIAquick (QIAgen) y se eluyeron en 35 µl de agua libre de nucleasas. Se realizó un tercer paso de amplificación con todo el ADN eluido en un volumen de 300 µl (6 × 50 µl) utilizando los mismos compuestos que para la segunda PCR, excepto una concentración diez veces mayor de los cebadores directo e inverso (250 fmol). La reacción de PCR se realizó como antes, pero sólo durante un único ciclo. Los productos de amplificación de 222 pb se purificaron en gel y se eluyeron en agua libre de nucleasas. El aislamiento del ADN y las tres amplificaciones por PCR consecutivas se realizaron en paralelo para los conjuntos de muestras completos, incluidos los controles correspondientes, para minimizar el sesgo.

Las muestras se secuenciaron en un sistema IonTorrent Ion S5™ XL (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) y los datos de secuenciación se procesaron y analizaron en la plataforma web Galaxy (usegalaxy.eu) utilizando Cutadapt (Galaxy versión 1.16.5), herramienta de recuento MAGeCK (Galaxy versión 0.5.8.4) y la herramienta de prueba MAGeCK (Galaxy versión 0.5.8.1) como se describe52,57,79,80. Los resultados de la secuenciación de dos condiciones diferentes ("Control" frente a "Superviviente") se compararon utilizando el método de agregación de rangos robustos (RRA) de la herramienta de prueba MAGeCK57.

Para la generación dirigida de células knockout SLA-DMA, SLA-DMB, CIITA o RFXAP, se seleccionó uno de los cuatro sgRNA específicos de genes de toda la biblioteca del genoma (Figura complementaria S1 y Tabla S4) y se clonó en el multiplex CRISPR/Cas9. vector pX330A-1×4 que fue un regalo de Takashi Yamamoto (plásmido Addgene # 58768; http://n2t.net/addgene:58768; RRID:Addgene_58768)81 y que fue modificado para expresar un gen de resistencia a la neomicina (neoR; denominado como pX330A-1×4neoRA). Para obtener pX330A-1×4neoRA, el vector pX330A-1×4 de 8962 pb se linealizó dentro de una región no funcional mediante digestión con PciI, y neoR bajo el control del promotor temprano del virus simio 40 (SV40) se insertó como un PciI de 1667 pb. fragmento aislado de pX330-ΔNLS1/2neoR55. En el plásmido resultante, este gen de resistencia estaba orientado en paralelo a los genes sgRNA y Cas9. A continuación, se hibridaron, fosforilaron y clonaron oligonucleótidos de ADN complementarios que contenían las secuencias específicas de la diana de los sgRNA con salientes 5' correspondientes (Eurogentec; Tabla complementaria S7) en pX330A-1×4neoRA digerido y desfosforilado con BpiI. La precisión de los plásmidos resultantes se verificó mediante secuenciación con el cebador HU6-SF (Tabla complementaria S5). Los plásmidos pX330A-1×4neoRA-SLA-DMA gR2, -SLA-DMB gR3, -MHCIITA gR2 y -RFXAP gR2 se transfectaron en células WSL clonadas utilizando el sistema de transfección K2® (Biontex) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de tres días, las células se tripsinizaron, se diluyeron en serie y se sembraron en placas de 96 pocillos utilizando medios suplementados con 0,5 mg/ml de sulfato G418 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Los clones de células individuales resistentes se propagaron y comprobaron mediante inmunotransferencia para determinar la expresión de Cas9 utilizando un anticuerpo anti-FLAG (ver más abajo). El ADN de las células Cas9 positivas se preparó usando el QIAamp DNA Mini Kit (QIAgen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se usó para la PCR y la secuenciación posterior de los productos de la PCR para confirmar la integración de las secuencias de sgRNA, así como las inserciones o eliminaciones de nucleótidos dentro del genes objetivo. Los cebadores utilizados para PCR y secuenciación se enumeran en la Tabla complementaria S5.

Las secuencias codificantes de SLA-DMA (GenBank #NC_010449.5, nt 25133494 a 25137928) y SLA-DMB (GenBank #NC_010449.5, nt 25119278 a 25125089) se empalmaron in silico y se optimizaron los codones. También se aseguró que las regiones de unión del sgRNA seleccionado se alteraran en la medida de lo posible mediante sustituciones de bases silenciosas (Figura complementaria S5). Los plásmidos personalizados (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) pMA-SLA-DMA y -DMB contenían sitios de restricción 5'-EcoRI y 3'-NotI para una reclonación conveniente de los ORF, y sitios de escisión BpiI únicos inmediatamente aguas arriba de los codones de terminación. , que permitió la inserción en marco de oligonucleótidos hibridados (Eurofins Genomics; Tabla complementaria S7), que codifican una etiqueta StepII (WSHPQFEK) o una etiqueta Myc (LEQKLISEEDL), respectivamente, en las construcciones digeridas con BpiI y NotI. Las inserciones correctas se verificaron mediante secuenciación utilizando el cebador M13 Rev (-24) (Tabla complementaria S5). Los ORF de SLA-DMA nativos y marcados con StrepII o Myc, así como los ORF de SLA-DMB nativos y marcados con Myc se volvieron a clonar como fragmentos EcoRI/NotI en el vector de lentivirus de 8140 pb correspondientemente digerido pLVX-IRES-Puro (TaKaRA/ Clontech). Como control, también se insertó el ORF que codifica la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) aislada como un fragmento EcoRI/NotI de 772 pb de pEGFP-N1 (Clontech), dando como resultado pLVX-EGFP-IRES-Puro. Se identificaron clones de plásmidos correctos mediante secuenciación utilizando el cebador promotor-F de CMV (Tabla complementaria S5). La expresión de proteínas se confirmó en células RK13 transfectadas (reactivo X-tremeGENE™ HP, Roche) con los plásmidos recién generados y análisis de inmunotransferencia utilizando anticuerpos anti-Myc y anti-Strep.

Se generaron lentivirus que codifican los genes SLA-DMA-Strep, SLA-DMA-Myc, SLA-DMB-Myc y EGFP, respectivamente, o pLVX-IRES-Puro vacío en células T HEK-293 de acuerdo con el protocolo descrito por Joung, et al.78 Se transdujeron clones de células WSL, WSL SLA-DMAKO (11) y WSL SLA-DMBKO (9) y se seleccionaron células knockout/knockin (WSLKO/KI) usando 1 µg/ml de puromicina. La eliminación del gen nativo y la integración del transgén se confirmaron mediante PCR y secuenciación utilizando los cebadores enumerados en la Tabla complementaria S5. La expresión del transgén se confirmó nuevamente mediante inmunotransferencia como se describe a continuación.

Los plásmidos generados y los fragmentos genómicos relevantes amplificados por PCR (KOD Xtreme Hot Start DNA Polymerase, Merck) de líneas celulares WSL recombinantes se secuenciaron con los cebadores indicados y el kit de secuenciación de ciclos BigDye™ Terminator v1.1 (Thermo Fisher Scientific), en un Analizador genético Applied Biosystems 3500 (Thermo Fisher Scientific). Los resultados se evaluaron utilizando el paquete de software Geneious Prime 2021.0.1 (Biomatters, disponible en https://www.geneious.com).

Las células se tripsinizaron, se resuspendieron en medio que contenía FCS al 10%, se centrifugaron y se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Luego, las células sedimentadas se lisaron en dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS) que contenía tampón de muestra (Tris-HCl 0,13 M, pH 6,8; SDS al 4%; glicerol al 20%; azul de bromofenol al 0,01%; 2-mercaptoetanol al 10%), se sonicaron y Se incubaron durante 5 min a 95 °C. Las proteínas se separaron en geles discontinuos de poliacrilamida SDS y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon durante 3 h a temperatura ambiente con leche desnatada al 5 % en solución salina tamponada con tris con Tween 20 al 0,25 % (TBS-T) y se sondaron durante la noche con anticuerpos primarios específicos diluidos en leche desnatada al 0,5 % en TBS-T. Unión de anti-FLAG monoclonal (clon M2, #F1804, Sigma-Aldrich), anti-α-tubulina (#T5168, Sigma-Aldrich) y anti-StrepII policlonal de conejo (#4217, ProSci), anti-Myc (#PA1 -581, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), anticuerpos anti-HLA-DMA (H00003108-D01P, Abnova) y anti-HLA-DMB (H00003109-D01P, Abnova) se visualizaron con IRDye 800CW anti-conejo de burro marcado con fluoróforo secundario (#926-32213, Li-Cor Biosciences) o anticuerpos anti-ratón IRDye 680RD de burro (#926-68072, Li-Cor Biosciences) en TBS-T. Las señales fluorescentes se detectaron con un sistema de imágenes infrarrojas Odyssey CLx (CLX-2293; Li-Cor Biosciences).

Se sembraron células WSL, WSLKO y WSLKO/KI a una densidad de 4 x 105 células por pocillo en placas de 24 pocillos. Al día siguiente, los virus se diluyeron en serie en medio de cultivo celular suplementado con FCS al 5% y se aplicaron a las capas celulares confluentes. Las células se incubaron durante 2 h a 37 °C y 2,5% de CO2. Posteriormente, se eliminó el inóculo y se reemplazó con medio metocel (6 g/L de metilcelulosa en MEM con 5% de FCS). La infección por PrV se visualizó y documentó como se describe a continuación mediante la expresión GFP inherente de PrV-BaΔgGG tres días después de la infección. Cuatro días después de la infección por ASFV, se eliminó el medio y las células se lavaron una vez con PBS antes de fijarlas con paraformaldehído al 4% en PBS (PFA) durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT). La fijación de formaldehído se detuvo mediante lavado y posterior incubación con NH4Cl 5 mM en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces con PBS y se almacenaron a 4 °C hasta la detección del antígeno del VPPA mediante pruebas de inmunofluorescencia indirecta (IF) (ver más abajo).

Las células, los focos y las placas infectados con ASFV y PrV se visualizaron con un microscopio de fluorescencia motorizado Leica DMi8. Utilizando el software Leica Application Suite X, se tomaron imágenes de pocillos completos y se fusionaron las imágenes de mosaico resultantes. Para cada virus y cada línea celular, se determinaron las áreas de 50 células o placas infectadas utilizando la herramienta de selección a mano alzada de ImageJ (Versión 1.53f51; http://imagej.nih.gov/ij) en tres experimentos independientes. Los tamaños medios de placa de los virus respectivos cultivados en células WSL se establecieron en 100 % y los tamaños medios relativos de placa de los virus cultivados en células WSLKO o WSLKO/KI, así como las desviaciones estándar, se calcularon utilizando GraphPad Prism (Versión 9). Para determinar la eficacia del cultivo en placas, se contaron las placas y se calcularon los títulos aparentes como UFP/ml.

Se sembraron células WSL, WSLKO y WSLKO/KI a una densidad de 4 x 105 células (para infección por PrV) o 3 x 105 células (para infección por ASFV) por pocillo en placas de 24 pocillos. Un día después, se aplicaron PrV-BaΔgGG, ASFV Armenia o ASFV Kenya a una MOI de 0,02. Después de una incubación a temperatura ambiente (PrV) o 37 °C (ASFV) durante 2 h, las células se lavaron una vez con medio y posteriormente se cubrieron con 1 ml de medio que contenía penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco). Las células infectadas con PrV se congelaron tres días después de la infección a -80 °C. Se congelaron placas individuales de células infectadas con ASFV inmediatamente después de la adición del medio, así como cada 24 h hasta las 168 h pi. Para la valoración, se descongelaron las placas y los lisados ​​se transfirieron a tubos de reacción. Después de la centrifugación a 2655 xg y 4 °C durante 5 minutos, los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos y se almacenaron a -80 °C. Las valoraciones de virus se realizaron en células RK13 (PrV) o células WSL (ASFV) confluentes en placas de 96 pocillos. Después de la inoculación con diluciones en serie de los sobrenadantes del virus (100 µl/pocillo), las células se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente en un balancín (PrV) o se centrifugaron durante 1 h a 689 xg y 37 °C (ASFV) antes de que se eliminara el sobrenadante del virus. Se eliminó y las células se cubrieron con medio metocel. Las células se incubaron durante 3 días (PrV) o 4 días (ASFV) a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 2,5%. Las células infectadas con PrV se fijaron durante 1 h mediante la adición de una solución de formaldehído al 3,7% y posteriormente se tiñeron con cristal violeta al 1% para visualizar las placas. Las células infectadas con ASFV se lavaron una vez con PBS, se fijaron con acetona/metanol helado (1:1, v/v) durante 30 minutos a -20 °C y se secaron al aire. Las células infectadas se visualizaron mediante tinción IF.

Para el análisis de la replicación del ADN viral, se sembraron células WSL y WSLKO a una densidad de 3 x 105 células en placas de 24 pocillos y se infectaron 24 h después con ASFV Armenia a una MOI de 3 en dos réplicas para cada vez. Después de una incubación de 2 h a 37 °C, se eliminó el inóculo y, después de un lavado, se reemplazó con medio. Después de 0, 2, 4, 8, 16 y 32 h a 37 °C, el medio se aspiró nuevamente y las células se lavaron una vez con PBS, se sedimentaron y se almacenaron hasta su posterior análisis a -20 °C. El ADN se preparó con el kit NucleoMag Tissue (Macherey-Nagel) según las recomendaciones del fabricante y se eluyó en 100 µl de tampón de elución.

La PCR cuantitativa en tiempo real para la detección de ADN se realizó utilizando el kit QuantiTect Multiplex PCR NoROX (Qiagen) en reacciones de 12,5 µl que contenían 2,5 µl de ADN de células infectadas según las instrucciones del fabricante. Los pares de cebadores específicos del gen ASFV B646L AKB646L-408F y AKB646L-507R, así como el par de cebadores específicos del gen β-actina ACT-CP-F y ACT-CP-R (Tabla complementaria S5) se incluyeron a 800 nM. y las sondas TaqMan AKB646L-460P y ACT-CP-P (Tabla complementaria S5) a concentraciones finales de 160 nM. El cebador y las sondas se adquirieron en Eurogentec. Las muestras se incubaron durante 15 min a 95 °C seguido de 45 ciclos de 30 s 95 °C, 30 s 55 °C y 30 s 68 °C en una máquina de PCR en tiempo real Bio-Rad C1000/CFX96, y los resultados se analizado utilizando el software CFX Maestro (Bio-Rad). Los números de copias del genoma del VPPA se determinaron basándose en curvas estándar generadas por reacciones que contienen 1010, 108, 106, 104, 102 o 100 copias de un plásmido de expresión p72 (pCAGGS-p72-Georgia, amablemente proporcionado por GM Keil).

Después de la fijación de las células con PFA como se describe anteriormente, las células se permeabilizaron opcionalmente con Triton-X 100 al 0,5% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Este paso no fue necesario para la visualización de proteínas de superficie, ni después de la fijación con acetona/metanol. Después de lavar con PBS, las células se bloquearon con FCS al 10% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, el anticuerpo policlonal de conejo anti-ASFV p7282 o el anticuerpo monoclonal de ratón anti-cerdo MHC II (clon MSA 3) (amablemente proporcionado por Luise Hartmann). y Ulrike Blohm) diluidos en tampón de bloqueo se aplicaron durante 1 h a temperatura ambiente y se detectaron con Alexa-Fluor 488 anti-conejo de cabra (#A11008, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) o Alexa-Fluor 488 anti-ratón de cabra (#A11001 , Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) anticuerpos secundarios diluidos en PBS durante otra hora. Para la detección del antígeno p72 en células WSLKO/KI, se utilizó el anticuerpo secundario de cabra anticonejo Alexa-Fluor 647 (#A21245; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) para permitir la visualización también en las líneas celulares de control que expresan GFP. Los ácidos nucleicos se tiñeron con Hoechst 33342 (#H3570; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de cada paso de incubación, las células se lavaron tres veces con PBS y finalmente se analizaron con un microscopio de fluorescencia Leica DMi8.

Se lisaron monocapas confluentes de WSL, WSL DMAKO (11), WSL DMBKO (9), WSL CIITAKO (1) y WSL RFXAPKO (6) (n = 3 por clon) en SDS al 2% en Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0). ) durante 10 min a 95 °C. Los lisados ​​se clarificaron mediante centrifugación (14.000 xg, 10 min, temperatura ambiente) y se recogieron los sobrenadantes. Se precipitaron alícuotas que contenían 100 µg de proteína (determinada mediante ensayo BCA) mediante la adición de 3 volúmenes de acetona enfriada con hielo. Los sedimentos de proteínas se recuperaron mediante centrifugación a 10.000 x ga 4 ° C durante 15 minutos y se digirieron en péptidos utilizando el kit de preparación de muestras EasyPep ™ Mini MS (Thermo Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Los péptidos se resuspendieron en ácido fórmico (FA) al 0,1% y los rendimientos de péptidos se evaluaron mediante ensayo BCA. Los péptidos (1 µg/muestra) se separaron en una HPLC nanoElute® (Bruker, Bremen, Alemania) equipada con una columna IonOpticks Aurora (25 cm x 75 µm ID, 1,6 µm C18) a una temperatura de 40 °C con un caudal de 400 nL/min acoplado a un instrumento timsTOF Pro (Bruker). El disolvente A era 0,1% FA y el disolvente B 0,1% FA en acetonitrilo. Los péptidos se eluyeron con un gradiente de 2 a 15 % de disolvente B (0 a 60 min), 15 a 24 % de disolvente B (60 a 90 min), 24 % a 34 % de disolvente B (90 a 105 min), 34 a 95 min. % disolvente B (105–107 min). El instrumento timsTOF Pro estaba equipado con una fuente de iones de nanoelectropulverización CaptiveSpray (Bruker) y se operó en modo de acumulación paralela y fragmentación en serie (PASEF) utilizando el método DDA estándar para análisis de proteoma (tiempo de ciclo de 1,1 s) recomendado por el fabricante.

Los datos de MS sin procesar se procesaron con Fragpipe83 utilizando una base de datos con secuencias porcinas descargadas del repositorio de Ensembl84. El análisis cualitativo y cuantitativo de las identificaciones de proteínas se realizó utilizando el lenguaje estadístico R85 y Perseus v1.6.15.086. Se utilizó el paquete R gprofiler2 versión 0.2.187 para hacer referencia a los identificadores de proteínas porcinas con los genes correspondientes (nomenclatura HGNC).

Se sembraron células WSL, WSL SLA-DMAKO y WSL CIITAKO en placas de 6 pocillos a una densidad de 1,5 x 106 células/pocillo. 24 h después, se infectó una placa completa de cada tipo con ASFV Armenia a una MOI de 5. Se dejó que el virus penetrara en las células durante 2 h a 37 °C. Posteriormente, la suspensión de virus se eliminó y se reemplazó con medio nuevo que contenía penicilina/estreptomicina al 1%. 16 h después de la aplicación del virus, las células se rasparon en el medio y se transfirieron a un tubo de centrífuga de 50 ml. La suspensión celular se centrifugó durante 7 minutos a 350 x ga 4 ° C. Las células se lavaron una vez con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,2), antes de fijarlas con glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato (ambos electroforesis SERV) durante al menos 2 h a 4 °C. Las células fijadas se centrifugaron nuevamente (5 min, 1000 x g, 4 ° C) y el sedimento se incrustó en agarosa de bajo punto de fusión (Sigma Aldrich). Después de secar, la agarosa se cortó en trozos pequeños (1 mm3), se fijó posteriormente en OsO4 acuoso al 1% y se tiñó con acetato de uranilo al 2,5% (ambos electroforesis SERVA). Después de una deshidratación gradual en etanol, las muestras se aclararon en óxido de propileno y se infiltraron con Glycid Ether 100 (Electroforesis SERVA). Para la polimerización, las muestras se llenaron en cápsulas y se incubaron durante 3 días a 60 °C. Se recortó el punto de interés y las secciones ultrafinas preparadas se transfirieron a rejillas de níquel recubiertas de formvar (Plano, Wetzlar, Alemania). Todas las rejillas se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo antes de examinarlas con un microscopio electrónico de transmisión Tecnai Spirit (FEI, Eindhoven, Países Bajos) a un voltaje de aceleración de 80 kV.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (Versión 9.0). La importancia estadística de las diferencias en la eficiencia del revestimiento se calculó mediante ANOVA unidireccional ordinario seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. La significación estadística de las diferencias en el tamaño de la placa se estimó mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunn. El número de veces que se repitieron las mediciones se indica en la leyenda de cada figura. Un valor de p < 0,05 se consideró significativo y se presenta en las figuras en forma de asteriscos (* < 0,05, ** < 0,01, *** < 0,001, **** < 0,0001).

Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD034242. Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo están presentes en el artículo y/o en los materiales complementarios.

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Descargar referencias

Agradecemos enormemente la ayuda técnica de Christin Milde, Petra Meyer, Mandy Jörn, Patrick Zitzow y Anja Landmesser. Los aislados y mutantes del VPPA utilizados fueron amablemente proporcionados por Sandra Blome, Richard Bishop y Günther M. Keil. Además, agradecemos a Matthias Lenk y Sylvia Kohler por el almacenamiento y cultivo de células WSL, a Florian Pfaff por su ayuda con la secuenciación de Sanger, a Luise Hartmann y Ulrike Blohm por proporcionar el anticuerpo específico SLA-DR, y a Thiprampai Thamamongood y Martin Schwemmle por sus valiosas instrucciones sobre el establecimiento. y evaluación del cribado CRISPR/Cas9. Este trabajo ha sido apoyado por una subvención interna de la FLI.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Jolene Carlson

Dirección actual: Ceva Animal Health, Greifswald-Insel Riems, Alemania

Instituto de Virología Molecular y Biología Celular, Friedrich-Loeffler-Institut, Südufer 10, 17493, Greifswald-Insel Riems, Alemania

Katrin Pannhorst, Jolene Carlson, Julia E. Hölper, Elisabeth Wöhnke, Axel Karger y Walter Fuchs

Instituto Roslin, Universidad de Edimburgo, Midlothian, Reino Unido

Finn Gray y John Kenneth Baillie

Instituto de Virología Diagnóstica, Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems, Alemania

Dirk Hoeper

Instituto de Infectología, Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems, Alemania

Kati Franzke

Instituto Friedrich Loeffler, Greifswald-Island Riems, Alemania

Thomas C. Mettenleiter

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Conceptualización de la idea: WF y TCM; metodología: KP, JEH, DH, JC y WF; investigación: KP, JEH, JC, DH, EW y KF; análisis formal: KP, DH, EW y KF; validación: KP, WF y TCM; recursos: FG, JKB, JEH, AK y WF; visualización: KP, EW y KF; curación de datos: KP y AK; borrador original escrito: KP, WF, TCM con el apoyo de EW y KF; Todos los autores estuvieron de acuerdo y contribuyeron al borrador final del manuscrito.

Correspondencia a Katrin Pannhorst.

KP, WF, FG y JKB son inventores de una solicitud de patente pendiente relacionada con este trabajo. Los demás autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Pannhorst, K., Carlson, J., Hölper, JE et al. La proteína SLA-DM del complejo mayor de histocompatibilidad II no clásico es crucial para la replicación del virus de la peste porcina africana. Representante científico 13, 10342 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36788-9

Descargar cita

Recibido: 08 de diciembre de 2022

Aceptado: 09 de junio de 2023

Publicado: 21 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36788-9

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