La variabilidad del número de copias genómicas a nivel de género, especie y población impacta los análisis ecológicos in situ de dinoflagelados y floraciones de algas nocivas.

Comunicaciones ISME volumen 3, Número de artículo: 70 (2023) Citar este artículo

768 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

La aplicación de metacódigos de barras, qPCR y metagenómica a comunidades microbianas eucarióticas acuáticas requiere conocimiento de la variabilidad del número de copias genómicas (CNV). La CNV puede ser particularmente relevante para los genes funcionales, lo que afecta la dosis y la expresión, pero se sabe poco sobre la escala y el papel de la CNV en los eucariotas microbianos. Aquí, cuantificamos la CNV del ARNr y un gen implicado en la síntesis de la toxina paralítica de los mariscos (PST) (sxtA4), en 51 cepas de 4 especies de Alexandrium (Dinophyceae). Los genomas variaron hasta tres veces dentro de las especies y ~7 veces entre especies, siendo el más grande (A. pacificum, 130 ± 1,3 pg célula-1 /~127 Gbp) en la categoría de tamaño más grande de cualquier eucariota. El número de copias genómicas (GCN) del ARNr varió en 6 órdenes de magnitud entre Alexandrium (102-108 copias de célula-1) y se relacionó significativamente con el tamaño del genoma. Dentro de la población, la CNV del ARNr fue de 2 órdenes de magnitud (105 – 107 células-1) en 15 aislamientos de una población, lo que demuestra que los datos cuantitativos basados en genes de ARNr necesitan considerable cautela en la interpretación, incluso si se validan contra cepas aisladas localmente. A pesar de hasta 30 años en cultivo de laboratorio, el ARNr CNV y la variabilidad del tamaño del genoma no se correlacionaron con el tiempo en cultivo. El volumen celular se asoció solo débilmente con el rRNA GCN (variación del 20 al 22% explicada entre los dinoflagelados, 4% en Gonyaulacales). El GCN de sxtA4 varió de 0 a 102 copias de célula-1, se relacionó significativamente con las PST (ng de célula-1), mostrando un efecto de dosificación genética que modula la producción de PST. Nuestros datos indican que en los dinoflagelados, un importante grupo de eucariotas marinos, los genes funcionales de baja copia son objetivos más confiables e informativos para la cuantificación de procesos ecológicos que los genes de ARNr inestables.

La variación del número de copias genómicas (CNV) está cada vez más documentada en genomas eucariotas, bacterianos y arqueales [1,2,3,4,5], y representa una fuente importante de variación genética intraespecífica y a nivel de población. El impacto de la CNV en la expresión de rasgos fenotípicos se ha caracterizado en investigaciones sobre plantas con flores, vertebrados, levaduras y salud humana, incluidos muchos organismos modelo [1,2,3,4,5]. Las CNV eucariotas pueden conducir a un aumento de la expresión y la dosis, lo que proporciona una posible ventaja selectiva [1, 3, 5,6,7]. A pesar de su importancia potencial, la escala y el papel de la CNV en la mayoría de los organismos no modelo, incluidos los eucariotas microbianos marinos, no se conocen bien.

Si bien se ha informado de CNV en eucariotas microbianos marinos [8,9,10,11,12,13], y algunos estudios han indicado que los genes de ARNr podrían variar en el número de copias o secuencias [14, 15], todavía no está relativamente claro si CNV tiene un impacto significativo en los estudios ecológicos moleculares cuantitativos que emplean metacódigos de barras, metagenómica y qPCR [10]. Los estudios cuantitativos de ecología molecular de protistas marinos generalmente utilizan regiones del operón rRNA para análisis de estructuras comunitarias debido a la amplia cobertura de genes de rRNA en bases de datos de referencia, la capacidad de resolver taxones y un alto número de copias genómicas (GCN) en eucariotas (>102 celda-1) que ayuda en la sensibilidad de detección [9,10,11,12]. Sin embargo, en animales, hongos y plantas, las copias del gen rRNA están presentes de forma variable, de 102 a 104 copias de célula-1 [9, 10, 16,17,18], con un rango similar (103-104 copias de célula-1) en diatomeas (Stramenopiles) [19]. Otros grupos de eucariotas microbianos pueden mostrar una mayor variación, de 103 a 105 copias de célula-1 en ciliados (Alveolata) [11] y de 102 a 105 en foraminíferos (Rhizaria) [12]. En la mayoría de las especies de eucariotas microbianos, el número de copias del gen rRNA se considera más estable [19, 20]; sin embargo, relativamente pocos estudios han examinado esto [11, 12, 19].

Los dinoflagelados abarcan la mayoría de los taxones que forman floraciones de algas nocivas (FAN), además de constituir hasta el 50% de la biomasa microbiana eucariótica marina, por lo que son un constituyente importante de los ecosistemas microbianos acuáticos [13]. El tamaño del genoma varía considerablemente en los dinoflagelados (~1 Gb a >150 Gb), incluidos algunos de los genomas eucariotas más grandes conocidos, más grandes que los genomas más grandes de animales (pez pulmonado, 130 Gb) y plantas (Paris japonica, 149 Gb) [21,22, 23,24,25]. La duplicación de genes y la expansión a gran escala parecen haber ocurrido entre los genomas de dinoflagelados, y los genes codificantes a menudo están presentes en múltiples repeticiones en tándem [26,27,28,29,30]. Los genomas de especies simbiontes de coral (Dinophyceae: Symbiodinaceae) muestran una evolución altamente dinámica, impulsada por la expansión de la familia de genes a través de la duplicación en tándem [28, 29] y la retroposición [31, 32]. Se producen variaciones considerables en el tamaño del genoma y genomas muy grandes en múltiples órdenes de dinoflagelados planctónicos [33], así como en otros grupos de eucariotas microbianos marinos como los foraminíferos, los ciliados y los amoebozoos [33]. El GCN de los genes de ARNr en gran parte de la vida eucariota se considera ampliamente correlacionado con el tamaño del genoma [18]. Tamaños de genoma tan grandes y dinámicos sugieren que puede existir una CNV sustancial en estos taxones.

De las floraciones de algas marinas nocivas que forman taxones, aquellas que producen toxinas paralíticas de mariscos (PST) son comunes y tienen importantes implicaciones económicas y de salud pública [34]. La expresión de PST puede constituir un mecanismo de defensa inducible en dinoflagelados marinos en respuesta a la presencia de depredadores copépodos [35]. Los PST son sintetizados por los dinoflagelados marinos cosmopolitas y comunes especies de Alexandrium, Pyrodinium bahamense, Gymnodinium catenatum y Centrodinum punctatum. Los genes de dinoflagelados asociados con la biosíntesis de PST (sxt) [36,37,38] poseen características de dinoflagelados, como una secuencia líder empalmada única de 22 pb en las transcripciones, un alto contenido de GC y colas poli-A eucariotas [36, 38]. Se cree que una proporción relativamente baja de genes (~10–27%) en los dinoflagelados están regulados a nivel transcripcional [21, 23, 26], con muchos genes regulados postranscripcionalmente. Por lo tanto, el papel de la dosis de genes que actúa sobre este rasgo puede diferir en los dinoflagelados del de los taxones más altamente regulados transcripcionalmente. Los estudios de ciertas especies como A. minutum y A. ostenfeldii han indicado que puede existir una correlación entre el contenido de PST celular y las copias genómicas del gen biosintético de PST sxtA4 [39,40,41]. Algunos estudios han demostrado que la síntesis de PST puede no estar regulada a nivel transcripcional [42, 43]. Se ha descubierto que este gen varía en GCN entre los estudios, ya que A. pacificum y A. catenella muestran ~180–325 copias de célula-1 de sxtA4 [40, 44, 45]; mientras que A. minutum y A. ostenfeldii mostraron menos copias, entre 1,5 y 11 copias de célula-1 [39, 41]. La mayoría de las especies de Alexandrium no tenían copias detectables de sxtA4 y no producen PST [46]. Por lo tanto, sxtA4 es un gen con un número de copias comparativamente menor en dinoflagelados que aquellos que muestran repeticiones en tándem a gran escala [26,27,28,29,30]. Si es consistente entre especies productoras de PST, GCN puede constituir un marcador útil para análisis ecológicos in situ de HAB y potencialmente para otros rasgos funcionales regidos por la dosis genómica.

Debido a que es probable que los genes de ARNr, en comparación con los genes codificantes, estén bajo diferentes presiones selectivas [47], los procesos que conducen a la CNV pueden diferir entre ellos. Para determinar el impacto de la CNV tanto en un gen funcional como en los marcadores de códigos de barras de ARNr, y para examinar el papel del tamaño del genoma y el tiempo en cultivo en la CNV, cuantificamos la CNV de los genes de ARNr y sxtA4 en relación con el tamaño del genoma en 51 cepas de PST- produciendo dinoflagelados marinos, Alexandrium australiense, A. pacificum, A. catenella y A. minutum. Nuestra selección de cepas brindó la capacidad de examinar la CNV dentro y entre especies, en cepas mantenidas en cultivo a largo plazo y la variación de la CNV entre regiones. A medida que el análisis de diversidad que emplea genes de ARNr en particular se vuelve omnipresente, nuestro objetivo fue determinar la escala de sesgos asociados con la CNV, examinar su prevalencia entre los dinoflagelados e indicar posibles soluciones.

Se establecieron quince cepas no axénicas de Alexandrium pacificum a partir de un lance de red de superficie recolectado el 22/11/18 en Mindarie Marina, Australia Occidental (−31.689127, 115.703103). El aislamiento de células individuales de A. pacificum se realizó utilizando pipetas de vidrio extraídas y un microscopio invertido Nikon Eclipse TS100 (aumento de 100x). Las células aisladas se transfirieron a placas de cultivo Falcon® de 24 pocillos que contenían 1 ml de medio K/5 [48] sin silicato de sodio. Se añadió dióxido de germanio (5 µg/ml) para impedir el crecimiento de diatomeas. Las placas se mantuvieron a 18 °C bajo un flujo de fotones de 60 a 100 μmol de fotones PAR m-2 s-1 con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h (fluorescente blanco frío). Después de 3 semanas, los cultivos se transfirieron a 20 ml de medio K en matraces de cultivo estériles de 70 ml (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.) y se mantuvieron mediante transferencias en serie cada 3 semanas. En total, se obtuvieron 36 cepas adicionales de 4 especies de Alexandrium (Alexandrium catenella, A. minutum, A. pacificum, A. australiense; Tabla complementaria 1) de colecciones: la Colección Nacional Australiana de Cultivos de Algas (CS), la Colección de Cultivos del Instituto Cawthon de Microalgas (CAWD), la Colección de Cultivos de Roscoff (RCC) y colecciones mantenidas en el Instituto de Estudios Marinos y Antárticos de la Universidad de Tasmania. Las cepas se originaron en 8 países diferentes de Europa, Asia, Australasia y América, en estados y regiones de Australia, y se aislaron en diferentes fechas dentro de los últimos 30 años.

La identidad del aislado se confirmó mediante la secuenciación de la región D1-D3 del ARNr de subunidad grande. Las células se recolectaron de 50 ml de cultivo mediante centrifugación y el ADN se extrajo utilizando el kit de centrifugación FastDNA para suelo (MP Biomedicals, Santa Ana, California, EE. UU.). La calidad del ADN se comprobó utilizando un espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts). La región D1-D3 de LSU-rRNA se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores D1F [49] y D3B [50] en reacciones de 25 µl que contenían 5 µl de tampón MyTaq 5X (Bioline, Londres, Reino Unido), polimerasa MyTaq (Bioline, Londres, Reino Unido) 0,5 µl, 7,5 pmol de cada cebador, 1 µg µl-1 BSA (Biolabs, Arundel, Australia), 1 µl de ADN y 15,5 µl de agua libre de ADN. Las condiciones de PCR fueron 94 °C por 5 min, seguido de 35 ciclos de: 94 °C por 30 s, 56 °C por 30 s y 72 °C por 1 min; y un paso final de extensión de 3 min. Los productos de PCR se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con GelRed (Gene Target Solutions, Dural, Australia) y purificado con Zymoclean™ (Zymo Research, California, EE. UU.). La secuenciación de los productos de Sanger fue realizada por Macrogen (Corea del Sur), con cepas asignadas a A. pacificum, A. catenella, A. minutum o A. australiense en base a comparaciones con secuencias de aislados verificados de cada especie.

Para medir el tamaño del genoma, CNV y PST, Alexandrium spp. se cultivaron hasta la fase exponencial en medio GSe [51] a 18 °C. Para medir el tamaño del genoma de cepas sincronizadas con el ciclo celular, las células se incubaron durante 48 h en la oscuridad para inducir la sincronización de la división celular [52, 53]. Las submuestras se fijaron con yodo de Lugol en el momento de la recolección y se determinó la concentración celular utilizando una cámara de recuento Sedgewick-Rafter (ProSciTech, Australia) y un microscopio de luz invertida (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Para la cuantificación de CNV con qPCR, se recolectaron entre 60 y 75 × 103 células por triplicado de cada cepa mediante centrifugación (10 min a 1000 g). Para la cuantificación del tamaño del genoma mediante citometría de flujo, se recolectaron aproximadamente 105 células por triplicado de cada cepa. Se recogieron al menos 106 células mediante centrifugación durante 10 minutos a 1000 g para medir la PST.

Las células se lavaron con 1 x PBS, se fijaron con paraformaldehído al 1% (p/v) durante 10 minutos y luego se lavaron nuevamente con 1 x PBS. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 2 ml de metanol frío, se almacenaron durante al menos 12 h a 4 °C para eliminar la clorofila intracelular, se lavaron dos veces con 1x PBS y luego se tiñeron durante > 3 h en 0,1 mg ml-1 de yoduro de propidio y 2 µg ml-1 de ARNasa (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania).

Para el análisis de citometría de flujo se utilizó un citómetro de flujo CytoFLEX S (Beckman Coulter, California, EE. UU.) equipado con excitación láser a 488 nm. Partículas BD™ DNA QC Se utilizaron como estándar células sanguíneas de pollo (3 pg de ADN/núcleo; BD Biosciences, San José, EE. UU.) [54]. En total, se utilizaron perlas fluorescentes de 2 µm como partículas estables para verificar la alineación del instrumento (BD Biosciences, San José, EE. UU.). Se procesaron muestras por triplicado a 30 µL min-1 y los datos se adquirieron en modos lineal y logarítmico hasta que se midieron al menos 10 000 eventos por muestra. Se detectó emisión de fluorescencia de ADN teñido con yoduro de propidio a 610 ± 10 nm. Las proporciones de picos y el coeficiente de variación (CV) se cuantificaron con el software CytExpert (Beckman Coulter, California, EE. UU.). El canal FSC se utilizó como disparador con configuración automática del fabricante. La sincronización y el análisis adicional solo se realizaron para picos con valores de CV inferiores al 20%, y cualquier pico por encima de esto se volvió a ejecutar. La selección se realizó utilizando la puerta FSC-A frente a SSC-A para excluir residuos y usando la puerta PI en el histograma para eliminar un gran ruido de fondo sin el contenido de ADN. El tamaño del genoma en pares de bases utilizó un factor de conversión de 1 pg de ADN = 978 Mbp [55].

La extracción de ADN se llevó a cabo utilizando un kit de extracción de ADN PowerSoil (QIAGEN, OH, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se extrajo por triplicado y la calidad y cantidad se determinaron utilizando un Nanodrop ND-1000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts) y un fluorómetro Qubit 2.0 (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts). La qPCR se llevó a cabo con un sistema BioRad CFX384 Touch™ (BioRad, California, EE. UU.) utilizando ensayos de qPCR específicos de especie para los genes de ARNr de Alexandrium [56] y sxtA4 [44] (Tabla complementaria 5, Figura complementaria 8). Las qPCR se ejecutaron por triplicado utilizando los siguientes parámetros de ciclado: 95 °C durante 10 s, 35 réplicas de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 30 s. El volumen total de reacción fue de 10 µl y contenía 5 µl de SybrSelect™ (ThermoFisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.), 0,5 µM de cada cebador, 1 µl de ADN molde y 3 µl de agua de calidad para PCR. Las muestras y la mezcla maestra se cargaron en placas de PCR Hard-Shell de 384 pocillos utilizando estaciones de trabajo de manipulación de líquidos epMotion 5075 (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania). La especificidad de la amplificación se confirmó mediante análisis de curva de fusión. Los valores del ciclo de cuantificación fueron generados por CFX Manager 3.1. Las curvas estándar de los genes sxtA4 y rRNA frente al ciclo de cuantificación (Cq) se desarrollaron utilizando una dilución en serie diez veces de fragmentos Gblocks® (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, EE. UU.). El número de copias por µL de ADN se determinó mediante la fórmula:

Se incluyeron curvas estándar, controles positivos y controles negativos en cada placa de muestra como muestra de ADN extraída de cepas de Alexandrium de concentración conocida (células µL-1). Las copias de los genes sxtA4 y rRNA por µL-1 de ADN se determinaron en relación con las curvas estándar de qPCR.

La importancia de las relaciones entre el tamaño del genoma, las copias del gen rRNA en la célula 1, las copias de sxtA4 en la célula 1 y el total de células PST 1 se evaluaron mediante la correlación de rangos de Spearman y la regresión lineal después de la transformación, según corresponda, tal como se implementó en GraphPad Prism 7.04. Se utilizaron pruebas de Shapiro-Wilk para examinar distribuciones normales o logarítmicas normales. Los patrones de tamaño del genoma y CNV del gen rRNA asociados con el cultivo celular se basaron en fechas de aislamiento proporcionadas por colecciones de cultivos y aisladores. Se calcularon los días desde la fecha de aislamiento hasta la fecha de extracción de la muestra. Para tener en cuenta las diferentes tasas de crecimiento de laboratorio, los días de cultivo se convirtieron al número estimado de generaciones según las tasas de crecimiento publicadas para cada especie en condiciones de mantenimiento del cultivo (50–80 μmoles PAR; ciclo 12:12 L:D 18–20 °C). Se calculó la varianza de las cepas individuales de las medias de las respectivas especies para el tamaño del genoma (pg) y el gen de ARNr log10 (copias de la célula-1). La desviación de la deformación individual de las medias de las especies se calculó usando ([(Xi - X̅)/σ)]. El efecto de los períodos de cultivo prolongados sobre la variabilidad en el tamaño del genoma y el gen GCN del ARNr se examinó utilizando la prueba de Levene para variaciones iguales entre los siguientes tres grupos de muestras: (1) aislados de Mindarie cultivados durante <20 generaciones; (2) cepas cultivadas durante 100 a 800 generaciones; (3) cepas cultivadas durante >1000 generaciones.

Los sedimentos celulares se liofilizaron, luego se extrajeron para determinar las PST y se midieron [53]. Brevemente, las muestras se resuspendieron en 2 ml de ácido acético 1 mM y se agitaron durante 90 s a 100 °C durante 5 min, se sonicaron durante 5 min y se filtraron con un filtro PVDF de 0,45 µm (Merck Millipore, Massachusetts, EE. UU.). La separación cromatográfica (modificada [57]) se realizó en un sistema UPLC Thermo Scientific™ ACCELA™ acoplado a un espectrómetro de masas Thermo Scientific™ Q Exactive™ (ThermoFisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.). El análisis se realizó utilizando una columna Acquity UPLC BEH Amide 130 A de 1,7 µm, 150 × 2,1 mm con un volumen de inyección de 5 µl. Las fases móviles fueron A1 (agua/ácido fórmico/NH4OH a 500:0,075:0,3 v/v/v), B1 (acetonitrilo/agua/ácido fórmico a 700:300:0,1 v/v/v). Las soluciones estándar certificadas de C1, C2, GTX1, GTX2, GTX3, GTX4, GTX5, dcGTX2, dcGTX3, STX, dcSTX, NEO y dcNEO se compraron del Consejo Nacional de Investigación de Canadá (NRC, Halifax, Canadá). El límite de detección del método de análisis PST para todos los compuestos objetivo fue de 0,01 pg de célula-1.

Los tamaños del genoma de todas las especies fueron grandes y variaron mucho entre especies, desde 22,5 ± 0,3 pg de célula-1 a 130,9 ± 1,3 pg de célula-1 (Fig. 1). El genoma de A. minutum fue el más pequeño (27,0 ± 2,0 pg célula-1, n = 16) mientras que las especies del complejo de especies de A.tamarense fueron mucho más grandes: A. catenella (79,2 ± 5,9 pg célula-1, n = 13 ), A. pacificum (72,5 ± 14 pg célula-1, n = 27) y A. australiense (87,3 ± 8,2 pg célula-1, n = 5). Las cepas de A. pacificum mostraron una variación de más de tres veces en el tamaño del genoma (42,4 ± 1,5 pg de célula-1 a 130,9 ± 1,3 pg de célula-1) (Fig. 1). El tamaño del genoma entre las cepas de A. pacificum de la misma población varió un 13% por encima y un 9% por debajo de la media de la población (CV = 5,1%, Fig. 1). Los genomas de A. pacificum de diferentes poblaciones, diferentes regiones globales y el tiempo en cultivo de laboratorio variaron en un rango más amplio (CV = 29,5%, Fig. 1); sin embargo, no hubo una relación clara entre el tamaño del genoma y el tiempo en cultivo de laboratorio, o aumento o disminución significativa en la variabilidad del tamaño del genoma a lo largo del tiempo en cultivo (Fig. 2a, Fig. 1A complementaria, F = 2.331, df = 2, p = 0.110).

Las imágenes muestran células usando microscopía de luz de fluorescencia, teñidas con calcoflúor blanco, de [83, 84].

a Variación en el tamaño del genoma de Alexandrium spp con generaciones en cultivo de laboratorio. Los valores son DE del tamaño medio del genoma. El sombreado de fondo más oscuro indica el rango de desviación entre las cepas de Alexandrium pacificum de Mindarie (WA) cultivadas durante <20 generaciones antes del análisis. b Variación en el número de copias de ARNr de especies de Alexandrium con el aumento de generaciones en cultivos de laboratorio. Los valores son DE del número medio de copias de ARNr de cada especie. El sombreado de fondo más oscuro indica el rango de desviación entre las cepas de Alexandrium pacificum de Mindarie (WA) cultivadas durante <20 generaciones antes del análisis.

El ARNr GCN varió en 6 órdenes de magnitud entre las especies de Alexandrium, desde 267 ± 18,8 copias de célula-1 en una cepa de A. minutum (RCC4877) hasta 1,23 × 108 ± 85 × 106 copias de célula-1 en una cepa de A. australiense ( AT-YC-H) (Fig. 3a). En general, las cepas de A. australiense y A. pacificum mostraron el rRNA GCN más grande, mientras que las de A. minutum fueron las más pequeñas y uniformes (Fig. 3a). La CNV intraespecífica de genes de ARNr fue sorprendentemente alta, particularmente entre los aislados de A. pacificum, que varió de 1,74 × 104 ± 1,26 × 103 copias célula-1 a 1,72 × 107 ± 1,40 × 107 copias célula-1, y más de dos ordena la magnitud (8,1 × 104 ± 1,40 × 104 copias celda-1 a 1,72 × 107 ± 1,41 × 107 copias celda-1) en una sola población (Fig. 4). El aumento de generaciones en cultivo de laboratorio (Fig. 2b, Fig. 1B complementaria) no tuvo ningún efecto sobre el ARNr GCN o CNV medio de las especies de Alexandrium (F = 1,819, df = 2, p = 0,177). La variabilidad fue evidente en las copias de sxtA4 en todas las especies de Alexandrium, aunque a una escala menor que en el gen de ARNr (Fig. 3c, Fig. 2 complementaria). El GCN sxtA4 de las cepas de A. pacificum mostró la mayor variabilidad, de 7,8 ± 1,9 copias de célula-1 a 609 ± 133 copias de célula-1, pero fueron más uniformes entre las cepas de la misma población (43,8 ± 9 copias de célula-1 - 609 ± 133 copias célula-1), mientras que la variabilidad de sxtA4 GCN en cepas de A. minutum y A. australiense fue baja, de 0 a 8,9 ± 0,61 copias célula-1 (Fig. 3c). Las cepas de A. catenella variaron entre 19,9 ± 10,5 copias de célula-1 y 189,12 ± 58,5 copias de célula-1 (Fig. 3c). Fue evidente una relación positiva significativa entre las copias de ARNr log10 de la célula-1 y el tamaño del genoma (Fig. 3b, F = 22,99, df = 49, p <0,0001, r2 = 0,319) en todas las especies de Alexandrium; sin embargo, a nivel de especie esto fue solo significativo dentro de A. pacificum (F = 6,7, gl = 18, p = 0,0185, r2 = 0,27). Se encontró una pendiente significativamente distinta de cero en la relación entre log10 copias de sxtA4 de la célula-1 y el tamaño del genoma, pero explica solo una cantidad muy baja de la varianza (Figura complementaria 2A, F = 5,3, df = 43, p = 0,026, r2 = 0,109).

una CNV de ARNr (±SD) en cepas de Alexandrium spp. b Relación entre el tamaño del genoma (pg de célula-1) y las copias de ARNr de la célula-1 en especies de Alexandrium (F = 22,99, df = 49, p <0,0001, r2 = 0,319). c CNV de sxtA4 (±SD) en especies de Alexandrium. d Relación entre PST totales (ng celda-1) y copias sxtA4 de la celda-1 en especies de Alexandrium (F = 11,73, df = 18, p = 0,003, r2 = 0,395).

a Sitios donde se aislaron cepas de A. pacificum de la región del Pacífico, incluidos sitios de toda Australia. b Mindarie de donde se aislaron cepas de A. pacificum. c CNV de sxtA4 (±SD) y rRNA (±SD) en Alexandrium pacificum de todos los sitios y solo de Mindarie.

Todas las cepas produjeron PST con excepción de A. australiense ATCJ33 y dos cepas de A. minutum, RC4874 y CCMI1002. La gama de congéneres de PST producidos varió considerablemente entre y dentro de las especies (Fig. 5). Las especies de A. catenella contenían el mayor contenido de PST (Fig. 5, 3d), dominado por C1, 2 y GTX1, GTX2, GTX3 y GTX4. Tanto GTX5, GTX6 como las versiones descarboxiladas de STX y NeoSTX estuvieron en su mayoría ausentes. Por el contrario, las cepas de A. minutum produjeron una gama más restringida de PST, produciéndose C2, GTX2 y GTX3 (Fig. 5). Las PST totales fueron más uniformes entre A. pacificum, sin variantes de PST consistentemente dominantes. Una relación positiva fue significativa entre log10 copias de sxtA4 de la célula-1 y log10 PST totales de la célula-1 (Fig. 3d, F = 11,73, df = 18, p = 0,003, r2 = 0,395). A. minutum produjo una mayor cantidad de PST por copia de sxtA4 en comparación con A. pacificum. Las cepas de A. australiense con PST extremadamente bajas o nulas detectables (ATCJ33, AADVN1, AT-YC-H), promediaron <1 célula de copia sxtA4-1. En los casos en los que se encontró menos de una copia de sxtA4 cell-1, esto se debió a números de copias por debajo del nivel de cuantificación del ensayo qPCR.

El mapa de calor muestra las variaciones entre especies e intraespecies de la concentración de cada congénere de PST en Alexandrium spp.

La CNV genómica en eucariotas, bacterias y arqueas se ha documentado cada vez más, a veces en relación con la duplicación del genoma completo o la poliploidía [1,2,3,4,5]. La CNV se considera un proceso evolutivo importante que influye en la expresión de rasgos fenotípicos clave [1, 2, 4,5,6,7]. La presencia de CNV también tiene importancia práctica, ya que afecta la forma en que se pueden interpretar los genes de códigos de barras moleculares, como el ARNr, comúnmente utilizados para análisis de estructuras comunitarias. La consistencia de la GCN no se comprende bien en los eucariotas microbianos, y rara vez se han examinado las causas y consecuencias de la CNV a nivel genómico [2, 4, 5].

Las estimaciones de CNV en otros eucariotas microbianos marinos sugirieron que la variación de 1 a 3 órdenes de magnitud en el ARNr, como se encontró en foraminíferos, ciliados, haptofitos, hongos y diatomeas, se consideró muy alta [10,11,12], y no fue siempre relacionado con el tamaño de la célula o del genoma [10, 58]. En este estudio, se encontró que el ARNr CNV en un género de algas dañinas comunes (Alexandrium spp) abarca ~6 órdenes de magnitud. Esto debe considerarse la variación mínima, ya que hemos estudiado comparativamente pocas especies de este género. Estimaciones anteriores de ARNr genómico en Alexandrium spp indicaron 102-103 copias de célula-1 en A. minutum, [16]; de 104 a 106 copias de la celda 1 en A. pacificum [9] y A. catenella [17, 44, 45], de acuerdo con nuestro estudio. También se conocen niveles muy altos de ARNr GCN (106) de otras especies de Gonyaulacales [59, 60] medidos utilizando técnicas que incluyen qPCR digital. Por lo tanto, las especies de Alexandrium abarcan desde las copias genómicas de ARNr más bajas hasta las más altas, célula-1 de dinoflagelados (Fig. 6a). En nuestro estudio, lo más significativo es que se encontró una NVC intraespecífica sustancial entre individuos recolectados de la misma población (Fig. 4), de hasta 2 órdenes de magnitud. Recientemente, se informó CNV de aproximadamente 1 orden de magnitud entre 14 cepas del haptofito Emiliania huxleyi de diferentes ubicaciones globales [10]. Utilizando qPCR unicelular, se encontraron dos órdenes de magnitud de diferencia en las copias del gen rRNA dentro de una especie de foraminíferos [12]. Nuestros resultados y estos estudios recientes indican que el ARNr CNV intraespecífico en eucariotas microbianos marinos puede ser común, lo que sugiere que se requiere que el gen de ARNr copie la célula 1 de múltiples cepas para determinar rangos de GCN razonablemente representativos. Si bien la CNV probablemente afecte los análisis de todos los eucariotas microbianos marinos, no abordar esto afectará particularmente a los conjuntos dominados por dinoflagelados, y asumir similitud en GCN en relación con el grado de relación filogenética parece ser ineficaz.

a Relación entre el tamaño del genoma log10 (pg de célula-1) y las copias de ARNr log10 de la célula-1 en dinoflagelados del estudio actual y la literatura anterior (F = 44,2, df = 74, p <0,0001, r2 = 0,374). Se muestran la línea de regresión y el intervalo de confianza del 95%. Círculos morados = Suessiales spp, círculos rojos = Gymnodiniales spp, círculos verdes = Prorocentrales spp, círculos naranja = Peridiniales spp, círculos azules = Gonyaulacales spp, círculos amarillos = Dinophysiales spp. Triángulos negros = datos del presente estudio. b Relación entre log10 volumen celular (μm3) y log10 copias de ARNr célula-1 en dinoflagelados, del presente y de los estudios anteriores (F = 0,26,59, df = 106, p <0,0001, r2 = 0,200). c Relación entre log10 volumen celular (μm3) y log10 copias de ARNr célula-1 en dinoflagelados, solo de estudios publicados (F = 16,4, df = 58, p = 0,0002, r2 = 0,2204). [datos de: 9, 10, 13, 19, 30, 38, 54, 55, 62, 63, 71, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81].

Las diferencias en GCN pueden ser el resultado de procesos a escala del genoma, incluida la poliploidía, así como de procesos que afectan parte del genoma, como aneuploidía, duplicaciones cromosómicas, errores durante la recombinación homóloga y la retroposición [27, 31, 32]. Las mutaciones y la selección mientras se mantienen en cultivos de laboratorio podrían dar lugar a CNV, potencialmente con implicaciones funcionales, como se ha informado en bacterias y hongos, y procesos específicos pueden afectar particularmente los loci de ARNr [3, 61]. En los genes de ARNr, la presencia de repeticiones en tándem que están altamente transcritas y la dificultad de replicar secuencias repetitivas hacen que el ADNr sea inherentemente menos estable que otros genes y susceptible a CNV [47]. Durante los ciclos de división celular, el ARNr GCN en levaduras y bacterias en cultivo mostró un patrón de reducción en hongos mediante pérdida mediada por recombinación [62,63,64]. Además de estos factores genéticos inherentes, los factores ambientales pueden provocar CNV inducida en genes de ARNr en algunos microbios [58, 61, 64, 65]. En los ciliados Entodinium, Epidinium y Ophryoscolex, el GCN del ARNr cambia en respuesta a la disponibilidad de nutrientes en los cultivos [65]. Un mayor rRNA GCN tiene implicaciones ecológicas, brinda protección contra mutágenos [62, 63] e impacta el crecimiento y la capacidad competitiva [58, 65].

Examinamos la CNV en relación con generaciones en cultura y regiones geográficas de aislamiento. Nuestras cepas abarcaron períodos en cultivo de varios meses a ~ 30 años, sin embargo, no se encontró ningún impacto significativo ni en la variabilidad del tamaño del genoma ni en la CNV del ARNr (Fig. 2, Fig. 1 complementaria), la diversidad genética intraespecífica en las copias del gen rRNA en A. pacificum de sitios distantes entre sí fue mayor en poblaciones naturales que la cantidad inducida por hasta 30 años de selección de laboratorio (Fig. 4). La fuente de dicha CNV puede ser la retroposición, ya que parece común en los dinoflagelados [21, 27, 31], y se descubrió que es la fuente de múltiples copias de pcna en los dinoflagelados [66], ya que las secuencias tenían restos de dinoflagelados específicos. secuencias líder empalmadas, que se agregan al ARNm, evidencia de transcripción inversa en el genoma. En Symbiodiniaceae, los cromosomas pueden enriquecerse en relación con procesos biológicos específicos, lo que sugiere que los cromosomas pueden duplicarse o perderse según sea necesario, creando CNV [28,29,30]. Ya sea a través de un proceso específico del ARNr, retroposición y/o duplicaciones cromosómicas, la CNV parece ocurrir en escalas de tiempo evolutivas largas según nuestros datos, ya que las tasas de mutación de dinoflagelados en una escala de tiempo decenal no fueron un factor significativo en la CNV alta.

Se ha calculado que <0,1% de las especies para las que se dispone de datos sobre el tamaño del genoma tienen genomas mayores a 100 Gb [24], destacando los genomas excepcionalmente grandes de los dinoflagelados [21, 22, 24, 28,29,30]. En eucariotas, no existe correlación entre el tamaño del genoma y las secuencias codificantes en genomas de más de 0,01 Gb, lo que se conoce como enigma del valor C [21, 26, 67]. Las especies de Alexandrium se encontraban en la mitad media y superior de los tamaños del genoma de dinoflagelados informados (Fig. 1, Fig. complementaria 2B), lo que indica expansión durante la evolución. Los tamaños del genoma sincronizado con el ciclo celular de A. pacificum variaron ~ 3 veces (Fig. 1), mayor que el rango ya amplio en informes anteriores de cepas de esta especie (60–104) pg célula-1 [9, 22, 40, 68 , 69]. Se encontraron 'cromosomas ribosómicos' especializados en el antiguo complejo de especies Alexandrium tamarense, incluido A. pacificum pero no en A. minutum, [68], que en nuestro estudio y en estudios previos mostró tamaños de genoma mucho más consistentes entre los aislados (22-29 pg celda-1 en estudios anteriores, como en este estudio [39, 40]). Una relación significativa entre el tamaño del genoma y las copias del gen rRNA-1 célula dentro de A. pacificum (Fig. 6a) puede indicar que la duplicación del cromosoma rRNA contribuye a la expansión del tamaño del genoma en esta especie [68], pero parece sin importancia dentro de las otras especies de Alexandrium examinadas.

Estudios anteriores han medido los genomas de dinoflagelados utilizando una variedad de métodos: citometría de flujo, tinción con yoduro de propidio u otros colorantes de ADN y utilizando células de pollo o un genoma animal de tamaño similar como estándar, así como estimaciones de la secuenciación del genoma (es decir, [22 , 28,29,30, 39, 66, 67, 70], Tabla complementaria 3). Las mediciones del tamaño del genoma basadas en citometría de flujo utilizando un estándar de un genoma animal, que es más pequeño y difiere estructuralmente de un genoma de dinoflagelado, pueden conducir a estimaciones del tamaño del genoma más grandes en comparación con las estimaciones de genomas de dinoflagelados secuenciados (Tabla complementaria 3). Sin embargo, el patrón no fue consistente y se determinaron algunas estimaciones similares independientemente del método (Tabla complementaria 3). Los dinoflagelados tienen genomas inusualmente grandes y, por lo tanto, generalmente no se dispone de estándares del tamaño apropiado. Nos aseguramos de que la curva estándar utilizada en esta medición lograra una buena linealidad para minimizar cualquier error potencial (Materiales complementarios).

Dada la ubicuidad de los análisis ecológicos microbianos eucarióticos que se dirigen habitualmente a genes de ARNr para qPCR y metacódigos de barras, puede parecer que dichos enfoques están muy bien caracterizados [9, 10, 13, 17, 20, 56, 59, 71]. Se ha prestado una atención considerable y justificable a las fuentes de sesgo que confunden los marcadores universales de genes de ARNr, en particular el sesgo de cebadores de PCR, el sesgo de secuenciación y el sesgo estadístico [3, 72, 73]. Se han desarrollado cebadores que abordan el sesgo de los cebadores [72, 73], los enfoques estadísticos han abordado otros sesgos; sin embargo, hasta hace poco se ha prestado menos atención al sesgo de GCN [3, 74,75,76]. La CNV es de particular preocupación para los ensayos basados en qPCR que se aplican cada vez más para la detección de especies de HAB como Alexandrium spp [9, 16, 17, 44, 45, 56, 59, 60]. Las estimaciones anteriores de la abundancia de células utilizando qPCR dirigida a ARNr de especies de HAB indican abundancias tanto sobreestimadas como subestimadas de hasta el 500% [45, 60, 77]. A pesar de la alta variabilidad en el rRNA GCN dentro de una población y especie (Fig. 4), es posible calibrar un resultado de qPCR con otro tipo de recuento de células ambientales mediante microscopía óptica detallada o citometría de flujo marcada con fluorescencia [44, 45, 60]. Un diseño de muestreo que integre CNV de múltiples poblaciones que coexisten en una región podría determinar un rRNA GCN local como proxy de calibración. Debido a que las tasas de mutación del ARNr GCN fueron bajas durante décadas (Fig. 2), si una especie de HAB se sembró a través de lechos de quistes locales, puede que no sea necesario recalibrar con cada muestra, ya que hacerlo mejoraría la simplicidad, velocidad y escalabilidad de La cuantificación basada en qPCR está obsoleta.

La elaboración de perfiles comunitarios mediante códigos de barras moleculares presenta un desafío potencialmente más difícil que la qPCR a la hora de adaptarse a la CNV, debido a la variabilidad desconocida entre taxones y la falta de información sobre GCN. Los factores de corrección de GCN son una opción para abordar este problema y pueden incorporarse en los análisis de códigos de barras [11, 74,75,76]. Sin embargo, los datos de GCN son muy limitados y están distribuidos de manera irregular. Los enfoques de corrección actuales se basan en la predicción utilizando taxones filogenéticamente relacionados [65]; sin embargo, el GCN de ARNr bacteriano y fúngico solo se conserva filogenéticamente moderadamente [58, 65, 74], lo que da como resultado predicciones de GCN cada vez más inexactas para linajes divergentes [65]. El primer estudio que intentó aplicar un factor de corrección de GCN para genes de ARNr microbianos marinos utilizó una única media de células GCN-1 para cada clase, de una base de datos de ~60 especies, de 4919 copias de células-1 para dinoflagelados, 166 copias de células-1 para diatomeas y 71.710 copias celda-1 para ciliados [77]. Si bien esto es una mejora con respecto al uso de GCN como indicador directo de la abundancia de ASV, el nivel de variabilidad encontrado en nuestro estudio muestra que dicho enfoque es limitado. Los tamaños del genoma, potencialmente un indicador de GCN [Fig. 6a], son variables y desconocidas para la mayoría de los dinoflagelados, por lo que este enfoque también parece inviable. [65] consideran que las soluciones basadas en bioinformática para la CNV de los genes de ARNr no son realistas para los eucariotas microbianos y, según nuestros datos actuales, estamos de acuerdo con esa posición.

El metacódigo de barras de eucariotas microbianos se ha denominado semicuantitativo, ya que se ha sugerido que la abundancia relativa de taxones puede ser proporcionalmente representativa de la comunidad [20]. Sin embargo, los análisis de sesgo en la codificación de metabarras de comunidades simuladas de dinoflagelados que utilizan múltiples cebadores dirigidos a genes de ARNr, o comparaciones con recuentos de microscopía, encontraron que las abundancias de ASV estaban muy sesgadas [78, 79]. Se ha argumentado que la falta de correlación entre el número de células y los genes de ARNr no es importante, ya que el gen de ARNr copia la célula-1 y se correlaciona con el volumen celular [13, 19, 20, 69] en eucariotas marinos, lo que proporciona una indicación más sólida de la función del ecosistema. que la abundancia celular. Sin embargo, solo encontramos una relación débil entre las copias del gen rRNA de la célula-1 con el volumen celular en los dinoflagelados, lo que explica solo el 20% de la varianza (Fig. 6b, F = 0.26.59, df = 106, p <0.0001, r2 = 0.200 ). Esto fue independiente de nuestro presente estudio, ya que, incluso cuando analizamos los datos publicados sobre la copia del gen rRNA, el volumen celular y el tamaño del genoma [9, 10, 16, 19, 22, 40, 59, 60, 67,68,69,70, 80,81,82,83,84,85] encontramos un 22% de la varianza explicada (Fig. 6c, F = 16,4, gl=58, p = 0,0002, r2 = 0,2204). Al analizar solo las copias de ARNr de la célula-1 en relación con el volumen celular de Gonyaulacales spp, el orden que incluye muchos de los taxones de HAB más importantes, no encontramos ninguna relación significativa (Fig. 6c, Fig. 2 complementaria, F = 3,26, gl = 85 , p=ns, r2 = 0,037). Esto puede ser indicativo de altas tasas evolutivas de genes de ARNr en este orden, observadas en relación con ramas de gran longitud en filogenias basadas en genes de ARNr [86]. Los dinoflagelados con los genomas más pequeños, como Suessiales spp, parecen mostrar una relación más directa entre el tamaño del genoma, el volumen celular y el GCN (Fig. 6a-c), pero aún se conocen poliploidía y duplicación cromosómica de estos taxones [85].

Dado que la función del ecosistema es generalmente de interés principal en la investigación ecológica microbiana, sugerimos que los metacódigos de barras se consideren una medida de presencia/ausencia de diversidad, y que los genes funcionales se cuantifiquen mediante metagenómica o ensayos de genes específicos en relación con los rasgos de interés. Nuestros datos indican que estaban presentes comparativamente menos copias del gen relacionado con la síntesis de PST, sxtA4, en cepas productoras de PST (2–102 copias de célula-1) en Alexandrium, con un rango más pequeño de CNV (Fig. 3c), consistente con estudios de sxtA4 en A. minutum (1,5 a 46 copias de célula 1; [39, 40]) y A. pacificum (34 a 200 copias de célula 1; [37, 40, 44]). Tanto la CNV reducida, combinada con la correlación significativa de sxtA4 GCN con PST cell-1 indican que sxtA4 es un objetivo informativo para el potencial de producción de PST in situ. Encontramos una variedad de análogos de PST producidos por especies de Alexandrium, y algunas especies como A.catenella son más consistentes en los análogos producidos que otras (Fig. 5). sxtA participa en la síntesis del compuesto original, saxitoxina, [36, 37] y las enzimas de adaptación en el grupo sxt parecen ser responsables de los análogos, lo que sugiere que en el futuro estos genes podrían cuantificarse. Una ventaja de la detección de sxtA es que se puede investigar la dinámica de la red alimentaria, por ejemplo, cuantificando la absorción de sxtA en invertebrados o protistas [87]. Ejemplos de genes funcionales similares que se han detectado o podrían detectarse in situ son genes relacionados con el ciclo celular, como el pcna implicado en la proliferación y el crecimiento de especies de HAB [66], transportadores, receptores, genes implicados en la absorción de N y P y otras funciones metabólicas [66]. 13, 21, 29, 30, 85]. Dado el potencial de que tales genes muestren una respuesta a la dosis en dinoflagelados, esto podría indicar un enfoque prometedor para la ecología comunitaria en ecosistemas dominados por dinoflagelados.

Hemos demostrado el gen CNV del ARNr de hasta 6 órdenes de magnitud en dinoflagelados a nivel de clase, género y especie, y su relación con el tamaño del genoma, pero no con las generaciones en cultivo de laboratorio, y muy débilmente con el volumen celular. Las correlaciones significativas reportadas entre el volumen celular y las copias genómicas de ARNr en eucariotas microbianos marinos probablemente fueron impulsadas por taxones con una organización genómica más sencilla, en lugar de dinoflagelados, ciliados y foraminíferos, que en conjunto pueden constituir la mayor parte de la señal de ARNr 18 S. Mostramos un efecto de dosis significativo de un gen funcional relacionado con una toxina HAB común, y sugerimos que dichos genes funcionales de baja copia son objetivos más estables e informativos para el perfil ecológico microbiano eucariótico, utilizando métodos basados en funciones como la metagenómica y los basados en rasgos específicos. ensayos moleculares.

Los datos estarán disponibles para todos los fines no comerciales.

Hardigan MA, Crisovan E, Hamilton JP, Kim J, Laimbeer P, Leisner CP, et al. La reducción del genoma descubre un gran genoma prescindible y un papel adaptativo para la variación del número de copias en Solanum tuberosum con población sexual. Célula vegetal. 2016;28:388–405.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Perry GH, Dominy NJ, Claw KG, Lee AS, Fiegler H, Redon R, et al. Dieta y evolución de la variación del número de copias del gen de la amilasa humana. Nat Genet. 2007;39:1256–60.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Soppa J. Poliploidía y estructura comunitaria. Microbiol natural. 2017;2:16261.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Conrad DF, Pinto D, Redon R, Feuk L, Gokcumen O, Zhang Y, et al. Orígenes e impacto funcional de la variación del número de copias en el genoma humano. Naturaleza. 2010;464:704–12.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zerulla K, Soppa J. Poliploidía en haloarchaea: ventajas para el crecimiento y la supervivencia. Microbiol frontal. 2014;5:274.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Iantorno SA, Durrant C, Khan A, Sanders MJ, Beverly SM, Warren WC, et al. La expresión genética en leishmania está regulada predominantemente por la dosis genética. bio. 2017;8:e01393-17.

Artículo de Google Scholar

Gillard GB, Gronvold L, Rosaeg LL, Holen MM, Monsen O, Koop BF, et al. La regulómica comparada respalda la selección generalizada de la dosis de genes después de la duplicación del genoma completo. Genoma Biol. 2021;22:103.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Keeling PJ, Campo JD. Los protistas marinos no son sólo grandes bacterias. Curr Biol. 2017;27:R541–R549.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Galluzzi L, Bertozzini E, Penna A, Perini F, Garcés E, Magnani M. Análisis del contenido del gen rRNA en los dinoflagelados mediterráneos Alexandrium catenella y Alexandrium taylori: implicaciones para los métodos de seguimiento cuantitativos basados en PCR en tiempo real. J Appl Phycol. 2010;22:1–9.

Artículo CAS Google Scholar

Gong W, Marchetti A. Estimación del número de copias del gen 18S en plancton eucariótico marino utilizando un enfoque de secuenciación de próxima generación. Frente de ciencia marina. 2019;6:219.

Artículo de Google Scholar

Wang C, Zhang T, Wang Y, Katz LA, Gao F, Song W. Desenredar las fuentes de variación en las secuencias de ADNr de SSU a partir de análisis unicelulares de ciliados: impacto de la variación del número de copias y el error experimental. Proc Biol Ciencia. 2017;284:20170425.

PubMed PubMed Central Google Académico

Milivojevic T, Rahman SN, Raposo D, Siccha M, Kucera M, Morard R. Alta variabilidad en el número de copias del gen SSU rDNA entre los foraminíferos planctónicos revelada por qPCR unicelular. Comunal ISME. 2021;1:63.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

de Vargas C, Audic S, Henry N, Decelle J, Mahé F, Logares R, et al. Plancton oceánico. Diversidad de plancton eucariota en el océano iluminado por el sol. Ciencia. 2015;348:1261605.

Artículo PubMed Google Scholar

Thornhill DJ, Lajeunesse TC, Santos SR. Medición de la diversidad del ADNr en sistemas microbianos eucariotas: cómo la variación intragenómica, los pseudogenes y los artefactos de la PCR confunden las estimaciones de biodiversidad. Ecología Mol. 2007;16:5326–40.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Egge E, Bittner L, Andersen T, Audic S, de Vargas C, Edvardsen B. 454 pirosecuenciación para describir la composición, diversidad y abundancia relativa de la comunidad microbiana eucariota: una prueba para haptofitos marinos. Más uno. 2013;8:e74371.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Galluzzi L, Penna A, Bertozzini E, Vila M, Garcés E, Magnani M. Desarrollo de un ensayo de PCR en tiempo real para la detección y cuantificación rápida de Alexandrium minutum (un dinoflagelado). Appl Environ Microbiol. 2004;70:1199–206.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Erdner DL, Percy L, Keafer B, Lewis J, Anderson DM. Un ensayo cuantitativo de PCR en tiempo real para la identificación y enumeración de quistes de Alexandrium en sedimentos marinos. Deep Sea Res Parte 2 Top Stud Oceanogr. 2010;57:279–87.

Artículo CAS PubMed Central Google Scholar

Prokopowich CD, Gregory TR, Crease TJ. La correlación entre el número de copias de ADNr y el tamaño del genoma en eucariotas. Genoma. 2003;46:48–50.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Godhe A, Asplund ME, Harnstrom K, Saravanan V, Tyagi A, Karunasagar I. Cuantificación de biomasas de diatomeas y dinoflagelados en muestras de agua marina costera mediante PCR en tiempo real. Appl Environ Microbiol. 2008;74:7174–82.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Le Bescot N, Mahé F, Audic S, Dimier C, Garet MJ, Poulain J, et al. Patrones globales de diversidad de dinoflagelados pelágicos en clases de tamaño de protistas revelados por metabarcodes. Microbiol ambiental. 2016;18:609–26.

Artículo PubMed Google Scholar

Lin S. Comprensión genómica de los dinoflagelados. Res Microbiol. 2011;162:551–69.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

LaJeunesse TC, Lambert G, Andersen RA, Coffroth MA, Galbraith DW. Los tamaños del genoma (contenido de ADN) de Symbiodinium (Pyrrhophyta) son los más pequeños entre los dinoflagelados. J Phycol. 2005;41:880–6.

Artículo CAS Google Scholar

Hackett JD, Scheetz TE, Yoon HS, Soares MB, Bonaldo MF, Casavant TL, et al. Información sobre el genoma de un dinoflagelado a través del análisis de etiquetas de secuencia expresada. Genómica BMC. 2005;6:80.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Hidalgo O, Pellicer J, Christenhusz M, Schneider H, Leitch AR, Leitch IJ. ¿Existe un límite superior para el tamaño del genoma? Tendencias de ciencia vegetal. 2017;22:567–73.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pellicer J, Hidalgo O, Dodsworth S, Leitch IJ. Diversidad del tamaño del genoma y su impacto en la evolución de las plantas terrestres. Genes (Basilea). 2018;9:88.

Artículo PubMed Google Scholar

Murray SA, Suggett DJ, Doblin MA, Kohli GS, Seymour JR, Fabris M, et al. Desentrañando la genética funcional de los dinoflagelados: una revisión de enfoques y oportunidades. Perspectiva Phycol. 2016;3:37–52.

Google Académico

Bachvaroff TR, plaza AR. De principio a fin: disposición de genes en tándem, número de copias y sitios de trans-empalme en el dinoflagelado Amphidinium carterae. Más uno. 2008;3:e2929.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu H, Stephens TG, González-Pech RA, Beltrán VH, Lapeyre B, Bongaerts P, et al. Los genomas de Symbiodinium revelan la evolución adaptativa de funciones relacionadas con la simbiosis coral-dinoflagelados. Biol Comunitario. 2018;1:95.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin S, Cheng S, Song B, Zhong X, Lin X, Li W, et al. El genoma de Symbiodinium kawagutii ilumina la expresión del gen dinoflagelado y la simbiosis de los corales. Ciencia. 2015;350:691–4.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Stephens TG, González-Pech RA, Cheng Y, Mohamed AR, Burt DW, Bhattacharya D, et al. Los genomas del dinoflagelado Polarella glacialis codifican genes de un solo exón repetidos en tándem con funciones adaptativas. BMC Biol. 2020;18:56.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Slamovits CH, Keeling PJ. Reciclaje generalizado de ADNc procesados en dinoflagelados. Curr Biol. 2008;18:R550–2.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Song B, Chen S, Chen W. Dinoflagelados, un linaje único para la investigación retrogénica. Microbiol frontal. 2018;9:1556.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Goetz EJ, Greco M, Rappaport HB, Weiner AKM, Walker LM, Bowser S, et al. Los foraminíferos como modelo de la amplia variabilidad en la dinámica del genoma entre eucariotas. Bioensayos. 2022;44:e2100267.

Artículo PubMed Google Scholar

Kouakou CRC, Poder TG. Impacto económico de la proliferación de algas nocivas en la salud humana: una revisión sistemática. J Salud del Agua. 2019;17:499–516.

Artículo PubMed Google Scholar

Ryderheim F, Selander E, Kiorboe T. La defensa inducida por depredadores en un dinoflagelado genera beneficios sin costos directos. ISME J. 2021;15:2107–16.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hackett JD, Wisecaver JH, Brosnahan ML, Kulis DM, Anderson DM, Bhattacharya D, et al. Evolución de la síntesis de saxitoxinas en cianobacterias y dinoflagelados. Mol Biol Evol. 2013;30:70–8.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Stuken A, Orr RJ, Kellmann R, Murray SA, Neilan BA, Jakobsen KS. Descubrimiento de genes codificados nucleares para la neurotoxina saxitoxina en dinoflagelados. Más uno. 2011;6:e20096.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Orr RJ, Stuken A, Murray SA, Jakobsen KS. Evolución y distribución de la biosíntesis de saxitoxinas en dinoflagelados. Mar Drogas. 2013;11:2814–28.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Stuken A, Riobo P, Franco J, Jakobsen KS, Guillou L, Figueroa RI. El contenido de toxina paralizante de los mariscos está relacionado con el número de copias genómicas de sxtA4 en cepas de Alexandrium minutum. Microbiol frontal. 2015;6:404.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Geffroy S, Lechat MM, Le Gac M, Rovillon GA, Marie D, Bigeard E, et al. Del gen sxtA4 a la producción de saxitoxina: ¿qué controla la variabilidad entre las cepas de alexandrium minutum y alexandrium pacificum? Microbiol frontal. 2021;12:613199.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Savela H, Harju K, Spoof L, Lindehoff E, Meriluoto J, Vehniainen M, et al. La cantidad del gen dinoflagelado sxtA4 y la densidad celular se correlacionan con la producción paralizante de toxina de mariscos en las floraciones de Alexandrium ostenfeldii. Algas nocivas. 2016;52:1–10.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Perini F, Galluzzi L, Dell'Aversano C, Iacovo ED, Tartaglione L, Ricci F, et al. Expresión de los genes SxtA y sxtG y producción de toxinas en el Alexandrium minutum (Dinophyceae) del Mediterráneo. Drogas del Mar. 2014;12:5258–76.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wiese M, Murray SA, Alvin A, Neilan BA. Expresión genética y evolución molecular de sxtA4 en un dinoflagelado productor de saxitoxina Alexandrium catenella. Toxico. 2014;92:102–12.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Murray SA, Wiese M, Stuken A, Brett S, Kellmann R, Hallegraeff G, et al. Ensayo molecular cuantitativo basado en sxtA para identificar floraciones de algas nocivas productoras de saxitoxina en aguas marinas. Appl Environ Microbiol. 2011;77:7050–7.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Murray SA, Ruvindy R, Kohli GS, Anderson DM, Brosnahan ML. Evaluación de ensayos de qPCR de sxtA y rDNA mediante el seguimiento de una floración costera de Alexandrium catenella Grupo 1. Sci Rep. 2019;9:14532.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Murray SA, Diwan R, Orr RJ, Kohli GS, John U. Duplicación, pérdida y selección de genes en la evolución de la biosíntesis de saxitoxina en alveolados. Mol Phylogenet Evol. 2015;92:165–80.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Salim D, Gerton JL. Inestabilidad del ADN ribosomal y adaptabilidad del genoma. Res. cromosómica. 2019;27:73–87.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Keller MD, Selvin RC, Claus W, Guillard RRL. Medios para el cultivo de ultrafitoplancton oceánico. J Phycol. 1987;23:633–8.

Artículo de Google Scholar

Scholin CA, Herzog M, Sogin M, Anderson DM. Identificación de marcadores genéticos específicos de grupo y cepa para Alexandrium (Dinophyceae) distribuido globalmente.II. Análisis de secuencia de un fragmento del gen LSU rRNA. J Phycol. 1994;30:999–1011.

Artículo CAS Google Scholar

Nunn GB, Theisen BF, Christensen B, Arctander P. Crecimiento de tamaño correlacionado por simplicidad del segmento de expansión nuclear 28S del ARN ribosómico D3 en el orden de los crustáceos Isopoda. J Mol Evol. 1996;42:211–23.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Doblin MA, Blackburn SI, Hallegraeff GM. Estimulación del crecimiento y biomasa del dinoflagelado tóxico Gymnodinium catenatum (Graham) mediante sustancias orgánicas disueltas. J Exp Mar Bio Eco. 1999;236:33–47.

Artículo CAS Google Scholar

Taroncher-Oldenburg G, Kulis DM, Anderson DM. Variabilidad de las toxinas durante el ciclo celular del dinoflagelado Alexandrium fundyense. Limnol Oceanogr. 1997;42:1178–88.

Artículo CAS Google Scholar

Figueroa RI, Garcés E, Bravo I. El uso de la citometría de flujo para la identificación de especies y estudios del ciclo de vida en dinoflagelados. Deep Sea Res Parte 2 Top Stud Oceanogr. 2010;57:301–7.

Artículo CAS Google Scholar

Vindelov LL, Christensen IJ, Nissen NI. Estandarización del análisis de ADN por citometría de flujo de alta resolución mediante el uso simultáneo de glóbulos rojos de pollo y trucha como estándares de referencia internos. Citometría. 1983;3:328–31.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Doležel J, Bartoš J, Voglmayr H, Greilhuber J. Contenido de ADN nuclear y tamaño del genoma de trucha y humano. Citometría Parte A. 2003;51A:127–8.

Artículo de Google Scholar

Ruvindy R, Bolch CJ, MacKenzie L, Smith KF, Murray SA. Ensayos de qPCR para la detección y cuantificación de múltiples especies de Alexandrium productoras de toxinas paralizantes de mariscos. Microbiol frontal. 2018;9:3153.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Harwood DT, Boundy M, Selwood AI, van Ginkel R. Refinamiento e implementación del método Lawrence (AOAC 2005.06) en un laboratorio comercial: rendimiento del ensayo durante un evento de floración de Alexandrium catenella. Algas nocivas. 2013;24:20–31.

Artículo CAS Google Scholar

Lofgren LA, Uehling JK, Branco S, Bruns TD, Martin F, Kennedy PG. Estimaciones basadas en el genoma de la variación del número de copias del ADNr de hongos entre escalas filogenéticas y estilos de vida ecológicos. Ecología Mol. 2019;28:721–30.

Artículo PubMed Google Scholar

Yarimizu K, Sildever S, Hamamoto Y, Tazawa S, Oikawa H, Yamaguchi H, et al. Desarrollo de un método de cuantificación absoluta del número de copias de genes de ARN ribosomal por célula individual eucariota mediante PCR digital. Algas nocivas. 2021;103:102008.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nishimura T, Hariganeya N, Tawong W, Sakanari H, Yamaguchi H, Adachi M. Ensayo de PCR cuantitativa para la detección y enumeración de dinoflagelados Gambierdiscus spp. que causan ciguatera. (Gonyaulacales) en zonas costeras de Japón. Algas nocivas. 2016;52:11–22.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nelson JO, Watase GJ, Warsinger-Pepe N, Yamashita YM. Mecanismos de mantenimiento del número de copias del ADNr. Tendencias Genet. 2019;35:734–42.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ide S, Miyazaki T, Maki H, Kobayashi T. La abundancia de copias de genes de ARN ribosómico mantiene la integridad del genoma. Ciencia. 2010;327:693–6.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kobayashi T. Regulación del número de copias del gen del ARN ribosómico y su papel en la modulación de la integridad del genoma y la adaptabilidad evolutiva en levaduras. Ciencia de la vida celular Mol. 2011;68:1395–403.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nemergut DR, Knelman JE, Ferrenberg S, Bilinski T, Melbourne B, Jiang L, et al. Disminuciones en el número promedio de copias del operón de ARNr de la comunidad bacteriana durante la sucesión. ISME J. 2016;10:1147–56.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lavrinienko A, Jernfors T, Koskimäki JJ, Pirttilä AM, Watts PC. ¿La variación intraespecífica en el número de copias de ADNr afecta el análisis de las comunidades microbianas? Tendencias en Microbiología. 2021;29:19–27.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hou Y, Ji N, Zhang H, Shi X, Han H, Lin S. Número de copias del gen pcna dependiente del tamaño del genoma en dinoflagelados y evidencia molecular de retroposición como mecanismo evolutivo importante. J Phycol. 2019;55:37–46.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hou Y, Lin S. Relaciones distintas entre el número de genes y el tamaño del genoma para eucariotas y no eucariotas: estimación del contenido genético para genomas de dinoflagelados. Más uno. 2009;4:e6978.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Figueroa RI, Cuadrado A, Stüken A, Rodríguez F, Fraga S. Patrones de organización del ADN ribosómico dentro del género de dinoflagelados Alexandrium revelados por FISH: ciclo de vida e implicaciones evolutivas. Protista. 2014;165:343–63.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Liu Y, Hu Z, Deng Y, Shang L, Gobler CJ, Tang YZ. Dependencia del tamaño del genoma y el número de copias del gen rRNA del volumen celular en dinoflagelados. Algas nocivas. 2021;109:102108.

Artículo PubMed Google Scholar

Kohli GS, John U, Figueroa RI, Rhodes LL, Harwood DT, Groth M, et al. Genes de síntesis de policétidos asociados con la producción de toxinas en dos especies de Gambierdiscus (Dinophyceae). Genómica BMC. 2015;16:410.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ott BM, Litaker RW, Holanda WC, Delwiche CF. Uso de secuencias de RDNA para definir especies de dinoflagelados. MÁS UNO. 2022;17:e0264143.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McNichol J, Berube PM, Biller SJ, Fuhrman JA Evaluación y mejora de la cobertura del cebador de PCR de ARNr de subunidades pequeñas para bacterias, arqueas y eucariotas utilizando metagenomas de Global Ocean Surveys. mSystems 2021; 6: https://doi.org/10.1128/msystems.00565-21.

Parada AE, Needham DM, Fuhrman JA. Cada base importa: evaluación de cebadores de ARNr de subunidades pequeñas para microbiomas marinos con comunidades simuladas, series temporales y muestras de campo globales. Microbiol ambiental. 2016;18:1403–14.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

González-de-Salceda L, García-Pichel F. La alometría del ADN celular y el contenido de genes ribosomales entre microbios y su uso para la evaluación de la estructura de la comunidad de microbiomas. Microbioma. 2021;9:173.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Louca S, Doebeli M, Parfrey LW. La corrección del número de copias del gen 16S rRNA en estudios de microbiomas sigue siendo un problema sin resolver. Microbioma. 2018;6:41.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Stoddard SF, Smith BJ, Hein R, Roller BRK, Schmidt TM. rrnDB: herramientas mejoradas para interpretar la abundancia de genes de ARNr en bacterias y arqueas y una nueva base para el desarrollo futuro. Ácidos nucleicos res. 2015;43:D593–598.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Godhe A, Cusack C, Pedersen J, Andersen P, Anderson DM, Bresnan E, et al. Intercalibración de técnicas clásicas y moleculares para la identificación de Alexandrium fundyense (Dinophyceae) y estimación de densidades celulares. Algas nocivas. 2007;6:56–72.

Artículo CAS Google Scholar

Smith KF, Kohli GS, Murray SA, Rhodes LL. Evaluación del enfoque de metabarcodes para el análisis comunitario de dinoflagelados bentónicos-epífitos utilizando comunidades simuladas. Res. marina de agua dulce de NZJ. 2017;51:555–76.

Artículo CAS Google Scholar

Santi I, Kasapidis P, Karakassis I, Pitta P. Una comparación de metodologías de microscopía y metabarcodificación de ADN para el estudio de eucariotas microbianos acuáticos. Diversidad. 2021;13:180.

Artículo CAS Google Scholar

Martin JL, Santi I, Pitta P, John U, Gypens N. Hacia la metacodificación cuantitativa del plancton eucariótico: un enfoque para mejorar el sesgo del número de copias del gen 18S rRNA. MBMG. 2022;6:e85794.

Artículo de Google Scholar

Kretzschmar AL, Verma A, Kohli G, Murray S. Desarrollo de un ensayo de PCR cuantitativo para la detección y enumeración de un dinoflagelado potencialmente productor de ciguatoxina, Gambierdiscus lapillus (Gonyaulacales, Dinophyceae). MÁS UNO. 2019;14:e0224664.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Menden-Deuer S, Lessard EJ. Relaciones carbono-volumen de dinoflagelados, diatomeas y otros plancton protistas. Limnol Oceanogr. 2000;45:569–79.

Artículo CAS Google Scholar

Zhu F, Massana R, Not F, Marie D, Vaulot D. Mapeo de picoeucariotas en ecosistemas marinos con PCR cuantitativa del gen 18S rRNA. FEMS Microbiol Ecológico. 2005;52:79–92.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Vandersea MW, Kibler SR, Holland WC, Tester PA, Schultz TF, Faust MA, et al. Desarrollo de ensayos de PCR semicuantitativos para la detección y enumeración de especies de Gambierdiscus (Gonyaulacales, Dinophyceae). J Phycol. 2012;48:902–15.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nand A, Zhan Y, Salazar OR, Aranda M, Voolstra CR, Dekker J. Organización genética y espacial de los cromosomas inusuales del dinoflagelado Symbiodinium microadriaticum. Genética de la naturaleza. 2021;53:618–29.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kretzschmar AL, Verma A, Murray S, Kahlke T, Fourment M, Darling AE. Ensayo por filogenética: evaluación del coalescente de múltiples especies para inferencia filogenética en taxones con altos niveles de paralogía (Gonyaulacales, Dinophyceae). bioRxiv. https://doi.org/10.1101/683383.

Farrell H, O'Connor WA, Seebacher F, Harwood TD, Murray S. Detección molecular del gen SxtA de Alexandrium minutum productor de saxitoxina en ostras comerciales. J Mariscos Res. 2016;35:169–77.

Artículo de Google Scholar

Descargar referencias

Agradecemos a Roscoff Culture Collection, Helene Hegaret, Laure Guillou, Marc Long, Malwenn Lassudrie, Cawthron Collection y CSIRO por los cultivos utilizados en este estudio. Agradecemos a Kun Xiao por la ayuda en la citometría de flujo. Agradecemos a Jacqui Stuart por su ayuda con las figuras. Este estudio fue financiado parcialmente por una beca UTS HDR para RR y un Consejo Australiano de Investigación FT para SM.

Universidad de Tecnología de Sydney, Facultad de Ciencias de la Vida, Sydney, PO Box 123, Broadway, NSW, 2007, Australia

Rendy Ruvindy, Abanti Barua, Henna Savela y Shauna A. Murray

Instituto de Estudios Marinos y Antárticos, Universidad de Tasmania, Launceston, 7248, TAS, Australia

Christopher JS Bolch

Instituto de Ciencias Marinas de Sídney, Chowder Bay Rd, Mosman, Nueva Gales del Sur, Australia

Chowdhury Sarowar

Instituto Finlandés del Medio Ambiente, Centro de Investigación Marina, Helsinki, Finlandia

Henna Savela

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

RR y SM conceptualizaron y diseñaron el estudio. RR, CB, SM, AB, CS generaron y analizaron datos, HS contribuyó al diseño experimental y a la recolección y análisis de muestras. RR, SM y CB escribieron el manuscrito con aportaciones de todos los autores.

Correspondencia a Shauna A. Murray.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ruvindy, R., Barua, A., Bolch, CJS et al. La variabilidad del número de copias genómicas a nivel de género, especie y población impacta los análisis ecológicos in situ de dinoflagelados y floraciones de algas nocivas. COMUN ISME. 3, 70 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00274-0

Descargar cita

Recibido: 23 de diciembre de 2022

Revisado: 18 de junio de 2023

Aceptado: 20 de junio de 2023

Publicado: 08 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00274-0

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Noticias

La variabilidad del número de copias genómicas a nivel de género, especie y población impacta los análisis ecológicos in situ de dinoflagelados y floraciones de algas nocivas.