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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12554 (2023) Citar este artículo

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Los metabolitos de degradación del triptófano formados a lo largo de la vía de la quinurenina desempeñan un papel importante en el embarazo y el desarrollo fetal. Para comprender su participación, es fundamental cuantificar los niveles de triptófano (TRP), quinurenina (KYN) y ácido quinurénico (KYNA) en muestras biológicas relevantes como la placenta, las membranas fetales y el cordón umbilical. Este estudio utilizó cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para determinar los niveles de TRP, KYN y KYNA. El método LC-MS/MS se optimizó para lograr una alta sensibilidad y especificidad, demostrando una buena reproducibilidad con una precisión de <10% CV y ​​una exactitud del 85-115%. El límite inferior de cuantificación tanto para TRP como para KYN fue de 0,5 µg/ml, mientras que para KYNA fue de 0,5 ng/ml. El método mostró linealidad dentro del rango de concentraciones examinado en el homogeneizado, que oscilaba entre 0,5 y 30 µg/ml para TRP y KYN y entre 0,5 y 25 ng/ml para KYNA. Utilizando este método, encontramos diferencias significativas en las concentraciones de estas sustancias en los compartimentos materno-fetales investigados. Las muestras de placenta exhibieron concentraciones más altas de KYN y más bajas de KYNA que las del cordón umbilical y la membrana fetal, lo que indica un papel potencialmente importante para las quinureninas al final del embarazo. En conjunto, este hallazgo puede facilitar más investigaciones y proporcionar información sobre la participación de la vía de la quinurenina del metabolismo de TRP en el desarrollo fetal.

El L-triptófano (TRP) es un aminoácido esencial que se metaboliza principalmente a través de la vía de la quinurenina (KP)1. En condiciones normales, el TRP es convertido por la triptófano 2,3-dioxigenasa hepática (TDO-2) y la indolamina 2,3-dioxigenasa extrahepática (IDO)-1 e IDO-22,3. Estas enzimas catalizan la conversión de TRP en N-formil-quinurenina, que puede metabolizarse aún más en L-quinurenina (KYN) y sus metabolitos posteriores, lo que finalmente conduce a la formación de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+)4.

El KP permite la formación de muchos metabolitos con diferentes funciones, incluida la modulación de la inmunidad5,6 y la inflamación7,8. Además, estos metabolitos desempeñan un papel fundamental en la fisiología del estrés, ya que los factores estresantes de la vida diaria pueden afectar la producción de metabolitos de degradación de TRP9. Uno de estos metabolitos es KYN, un agonista del receptor de aril hidrocarburo (AhR)10. Este receptor se expresa de forma ubicua en los tejidos humanos e implica muchas funciones metabólicas. Sin embargo, su activación también juega un papel esencial en procesos patológicos, incluyendo la inflamación y la carcinogénesis11,12. KYN actúa como precursor del ácido quinurénico (KYNA), un antagonista endógeno de los receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) y alfa7 nicotínico de acetilcolina, que participa en la inflamación13 y está ampliamente estudiado por su papel en diversos trastornos del sistema nervioso central. sistema nervioso (SNC)14,15,16. Estudios recientes han demostrado que KYNA es un agonista del receptor 35 acoplado a proteína G (GPR35)17 y AhR10. KYNA también sirve como biomarcador que se correlaciona directamente con eventos estresantes9,18. Por ejemplo, los modelos animales han revelado que el estrés aumenta la concentración de KYNA en el organismo con el tiempo, lo que resulta en una respuesta biológica generalizada al estrés dependiente de KYNA18,19.

Además, el KP participa en muchos procesos fisiológicos, desempeñando un papel esencial en el embarazo al regular la tolerancia vascular e inmune de la placenta y proporcionar neuroprotección1,2,20,21. Por ejemplo, el papel funcional de IDO en el mantenimiento del embarazo en la placenta de mamíferos se demostró in vivo, donde la inhibición de IDO resultó en la pérdida del embarazo en ratones22. Además, la TDO, otra enzima clave en la principal vía de degradación de TRP, mantiene la tolerancia inmune fetal y materna23.

En cuanto al embarazo y el tejido placentario, KYN puede atravesar la placenta y la barrera hematoencefálica fetal. Una única administración oral de KYN a ratones preñados elevó los niveles de KYN en el plasma y el cerebro fetal24. En estudios con animales, la suplementación continua con KYN a las madres causó problemas de memoria en las crías adultas de animales a los que se les administró KYN durante el período pre y posnatal24,25. Se ha demostrado que KYNA desempeña un papel esencial en el crecimiento fetal, particularmente en el desarrollo del SNC in utero, como lo demostraron Notarangelo y Schwarcz26. Dado que la placenta es un órgano vital en el desarrollo fetal y sirve como fuente principal de nutrientes y oxígeno para el feto en desarrollo, existe un interés creciente en comprender las funciones periféricas de KYNA en la fisiología del tejido placentario. A pesar de su papel crucial en los tejidos periféricos, la regulación de KYNA en la placenta sigue siendo poco conocida. TRP es un aminoácido necesario para la síntesis de proteínas y un precursor metabolizado junto con la serotonina y las KP. Curiosamente, hace unos años se demostró que TRP es un agonista del receptor acoplado a proteína G (GPR) 13927 y GPR14228. Los datos sobre el papel de estos receptores son ahora notablemente escasos. Si se confirma la presencia de estos receptores en los tejidos asociados al embarazo, la medición de los niveles de TRP cobrará nueva relevancia. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo investigar los niveles de TRP, KYN y KYNA presentando un método validado para su cuantificación en muestras de placenta humana, membranas fetales y cordón umbilical mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Este método proporciona una herramienta fiable y sensible para estudiar TRP, KYN y KYNA en muestras de placenta. Podría ofrecer información valiosa sobre la regulación del contenido de estas moléculas en la placenta y sus posibles implicaciones para el desarrollo fetal.

En este estudio se incluyeron placentas de 9 mujeres embarazadas sanas de entre 22 y 37 años (mediana: 34, IQR: 4), y las semanas de gestación oscilaron entre 37 semanas y 0 días y 40 semanas y 6 días (mediana: 38 semanas y un día). día; IQR semanas gestacionales = 1 y IQR días gestacionales = 4). No se informaron complicaciones médicas ni infecciones durante o después del nacimiento.

Se realizó cromatografía LC-MS/MS, como se detalla en nuestros métodos, para medir la concentración de TRP, KYN y KYNA en las muestras de tejido de la placenta materna, el cordón umbilical y la membrana fetal. Los tiempos de retención para TRP, KYN y KYNA en las tres muestras fueron inferiores a 4 min. Los cromatogramas de las tres muestras de tejido se representan en las Figs. 1 y 2. Los analitos exhibieron una linealidad excelente, con coeficientes de regresión (R2) superiores a 0,99, una precisión de menos del 10% CV y ​​una precisión del 85 al 115% (Fig. S1). El límite inferior de cuantificación (LLOQ) fue de 0,5 µg/ml para TRP y KYN y de 0,5 ng/ml para KYNA. Las concentraciones en los homogeneizados utilizados para la calibración fueron de 0,5 a 30 µg/ml tanto para TRP como para KYN y de 0,5 a 25 ng/ml para KYNA. Siempre que la señal excedía el rango, diluimos las muestras antes de procesarlas o ajustamos el volumen de inyección para permanecer dentro del rango de linealidad del método. Las concentraciones de TRP, KYN y KYNA se cuantificaron mediante LC-MS/MS (Figs. 3, S2, S3 y S4). Primero, determinamos la cantidad de TRP en los tejidos de la placenta, el cordón umbilical y la membrana fetal. Las concentraciones variaron entre las muestras, encontrándose la concentración más alta en los tejidos de la membrana fetal (3,63 ± 1,34 µg/mL), seguida del tejido del cordón umbilical (2,80 ± 0,20 µg/mL) y la placenta materna (1,35 ± 0,35 µg/mL). La diferencia pareció ser estadísticamente significativa entre la placenta y el cordón umbilical. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre la membrana fetal, la placenta materna y el cordón umbilical, probablemente debido a la alta variabilidad de las medidas intragrupo (Fig. 3A). Las concentraciones de KYN variaron entre las muestras. La concentración más alta se encontró en muestras de tejido de placenta materna (62,89 ± 6,35 µg/mL), seguida de muestras de membrana fetal (13,59 ± 5,30 µg/mL) y muestras de cordón umbilical (2,20 ± 0,54 µg/mL). Tanto en los tejidos del cordón umbilical como de la membrana fetal, los niveles de KYN fueron significativamente más bajos que en la placenta materna (Fig. 3B). Las concentraciones de KYNA fueron mayores en la membrana fetal (26,30 ± 3,80 ng/mL), seguida de los tejidos del cordón umbilical (18,08 ± 2,30 ng/mL) y las muestras de placenta materna (2,58 ± 0,32 ng/mL). En la placenta, los niveles de KYNA fueron significativamente más bajos que en el tejido del cordón umbilical y de la membrana fetal (Fig. 3C). Es de destacar el considerable valor del gradiente entre las concentraciones de las sustancias investigadas en los compartimentos materno-fetal estudiados, que es especialmente evidente para KYN y KYNA (Fig. 3D).

Monitoreo de reacciones múltiples de triptófano (TRP), quinurenina (KYN) y ácido quinurénico (KYNA). Los analitos están en azul, los estándares etiquetados isotópicamente están en rojo. Compuestos: triptófano (MRM monitoreado: 205,1 → 118, 205,1 → 146), [13C11, 15N2]-triptófano (MRM monitoreado: 218,1 → 127, 218,1 → 156), L-quinurenina (MRM monitoreado: 209,1 → 94, 209,1 → 146 ) y [13C6]-quinurenina (MRM monitoreado: 215 → 100, 215 → 152), ácido quinurénico (MRM monitoreado: 190 → 116, 190 → 144), ácido [2H5]-quinurénico (MRM monitoreado: 195,1 → 121, 195,1 → 149).

Cromatogramas MRM representativos para las muestras de placenta materna (A), membrana fetal (B) y cordón umbilical (C). En rosa: quinurenina (tiempo de retención 1,45 min). En verde: triptófano (tiempo de retención 2,78 min). En azul: ácido quinurénico (tiempo de retención 3,43 min).

Concentración de triptófano (A), quinurenina (B), ácido quinurénico (C) en placenta materna (MP), cordón umbilical (UC) y membrana fetal (FM) y gradiente de concentración intercompartimental (D). Los datos se presentan como media ± SEM, número de sujetos = 9 por grupo (A – C). El gradiente intercompartimental se calculó como la relación entre el contenido del cordón umbilical o de la membrana fetal de la sustancia investigada y su contenido placentario (adoptado como 1). *p < 0,05, ***p < 0,001 versus grupos indicados. Una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis indicó una diferencia estadística en la concentración de PRT entre al menos dos tejidos (p = 0,031). Las comparaciones múltiples de Dunn mostraron un menor contenido de TRP en MP versus UC (p <0,05). Una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis mostró una diferencia estadística en la concentración de KYN entre al menos dos tejidos (p <0,001). La prueba de comparaciones múltiples de Dunn evidenció un menor contenido de KYN tanto en UC (p < 0,001) como en FM (p < 0,05) en comparación con MP. El análisis ANOVA unidireccional reveló una diferencia estadística en la concentración de KYNA entre al menos dos tejidos (p <0,001). Las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey indicaron que la concentración media de KYNA fue significativamente mayor en UC (p <0,001) y FM (p <0,001) en comparación con MP.

Con base en estas mediciones, se calcularon las proporciones KYN/TRP y KYNA/KYN, que reflejan la actividad de las enzimas IDO y KAT, respectivamente. También se calculó la relación KYNA/TRP. En la placenta humana, determinamos una relación KYN/TRP significativamente mayor (7755,2 ± 1838,4) en comparación con el cordón umbilical (77,5 ± 16,47) y la membrana fetal (1777,0 ± 1035,2) (Figs. 4A y S5). La relación KYNA/KYN fue significativamente mayor en el cordón umbilical (0,0120 ± 0,0031) que en la placenta (0,000046 ± 0,000009) y la membrana fetal (0,0044 ± 0,0011) (Figs. 4B y S6). La relación KYNA/TRP fue mayor en la membrana fetal (0,0251 ± 0,0116) que en la placenta materna (0,0037 ± 0,0011) y el cordón umbilical (0,0067 ± 0,0009) (Figs. 4C y S7).

Relación quinurenina/triptófano (A), relación ácido quinurénico/quinurenina (B) y relación ácido quinurénico/triptófano (C) en la placenta materna (MP), el cordón umbilical (UC) y la membrana fetal (FM). Los datos se presentan como media ± SEM, un número de sujetos = 9 por grupo. *p < 0,05, ***p < 0,001 versus CU/FM. FM-membrana fetal, KYN-quinurenina, KYNA-ácido quinurénico, MP-placenta materna, TRP-triptófano, UC-cordón umbilical. Una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis indicó una diferencia estadística en la relación KYN/TRP entre al menos dos tejidos (p = 0,001). La prueba de comparaciones múltiples de Dunn mostró una relación KYN/TRP mayor en MP versus UC (p < 0,001). El análisis de ANOVA unidireccional reveló una diferencia estadísticamente significativa en la relación KYNA/KYN entre al menos dos tejidos (p = 0,001). La prueba de comparaciones múltiples de Tukey reveló que la relación KYNA/KYN fue significativamente mayor en UC versus MP (p <0,001) y significativamente mayor en UC versus FM (p <0,05). Una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis mostró una diferencia estadística en la relación KYNA/TRP entre al menos dos tejidos (p = 0,049). La prueba de comparaciones múltiples de Dunn evidenció una relación KYNA/TRP mayor en FM (p < 0,05) que en MP.

Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que compara las concentraciones de TRP, KYN y KYNA en muestras de tejido de placenta materna, membrana fetal y cordón umbilical de mujeres embarazadas mediante LC-MS/MS. Aunque se sabe que KYN y sus metabolitos desempeñan un papel en el desarrollo fetal, faltan estudios que investiguen los metabolitos de TRP y KP en estos tejidos. La mayoría de los investigadores miden el nivel de sustancias en la sangre, pero es fundamental conocer el contenido de las sustancias en el tejido, donde se encuentran sus posibles objetivos moleculares.

Este informe reveló concentraciones de KYNA significativamente más bajas pero concentraciones de KYN más altas en la placenta materna en comparación con los otros tejidos analizados. La PRT fue menor en la placenta que en el cordón umbilical. Además, la placenta materna exhibió una relación KYN/TRP significativamente mayor que el cordón umbilical. Por otro lado, la relación KYNA/KYN fue significativamente mayor en el cordón umbilical que en la placenta materna o la membrana fetal. La relación KYNA/TRP fue menor en la placenta que en la membrana fetal.

En cuanto a los aspectos técnicos del método analítico utilizado para evaluar TRP, KYN y KYNA, logramos una precisión del 85-115% y una precisión de <10% CV, con un LLOQ aceptable (0,5 µg/mL para TRP y KYN y 0,5 ng/mL para KYNA) y linealidad en el rango de concentración estudiado. El estudio de este método cumple con los criterios de los métodos bioanalíticos, y nuestros resultados fueron similares a los de estudios previos sobre el análisis de quinureninas en suero (Hu et al.29: < 10% CV; LLOQ: 1 µg/mL para TRP, 100 ng/mL para KYN y un ng/mL para KYNA (van Zundert et al.30: < 13% CV; LLOQ: 0,01 µmol/L para KYN y 0,04 µmol/L para TRP); sin embargo, no existen estudios que evalúen las quinureninas en el tejido placentario mediante LC/MS.

Nuestro estudio reveló concentraciones de KYNA entre siete y diez veces más bajas en muestras de placenta materna que en las otras dos muestras de tejido analizadas, a saber, el cordón umbilical y la membrana fetal. La concentración significativamente menor de KYNA encontrada en muestras de placenta materna puede tener relevancia fisiológica. Se ha demostrado que KYNA no atraviesa la barrera placentaria entre la madre y el feto, como se evidencia en ratones preñados31. Sin embargo, se informó una concentración de KYNA de hasta 1,13 μM en el líquido amniótico humano del último trimestre32. Este fenómeno puede indicar que ambos compartimentos están aislados y que la producción de KYNA en el feto se produce independientemente de la concentración plasmática materna. De hecho, un estudio realizado en cortes de tejido de ratones reveló que el cerebro fetal podría producir de 3 a 4 veces más KYNA que el cerebro y la placenta maternos, aunque menos que el hígado materno y fetal33. Sin embargo, también se ha sugerido que los niveles elevados de KYNA en la placenta están relacionados con condiciones patológicas maternas, como la preeclampsia, y un desarrollo fetal anormal, incluido un crecimiento fetal restringido y un desarrollo cerebral deficiente26. Estudios futuros deberían considerar evaluar las concentraciones de KYNA en condiciones médicas o psicológicas, como depresión o estrés psicológico perinatal, ya que KYNA también podría desempeñar un papel en el desarrollo del cerebro26 y su aumento está relacionado con el estrés26.

Aquí, mostramos un aumento de 5 y 25 veces en la concentración de KYN en la placenta materna en comparación con la membrana fetal y el tejido del cordón umbilical, respectivamente. Esta marcada compartimentación de KYN apunta a su alta importancia fisiológica local. Mecánicamente, esto es de alguna manera un fenómeno inesperado porque KYN se transporta fácilmente a través de barreras biológicas. Por lo tanto, la causa subyacente es presumiblemente la producción local de KYN. De hecho, estudios previos han demostrado que los niveles elevados de IDO dieron como resultado una actividad enzimática que conduce a un aumento en la concentración de KYN en los tejidos placentarios34. También se ha demostrado que la producción de KYN comienza en el primer trimestre, como se demuestra en un estudio ex vivo con cultivo de células placentarias35. Al final del embarazo, el desarrollo del sistema endotelial en la placenta es responsable de un aumento en la concentración de KYN debido a una mayor actividad de la enzima IDO34. Nuestro cálculo de la relación KYN/TRP, un sustituto de la actividad IDO, indicó una mayor actividad de esta enzima en las muestras de placenta materna, de acuerdo con estudios previos1,34. Además, se sabe que esta enzima está localizada en el sincitiotrofoblasto34,36 y aumenta a partir de la semana 14 de gestación en la placenta humana1, alcanzando concentraciones más altas al final del embarazo34. Karahoda y colegas también informaron una expresión y actividad significativas de la enzima IDO en las placentas a término34,37. Nuestro estudio es consistente con investigaciones anteriores, ya que encontramos una mayor proporción KYN/TRP placentaria en comparación con las muestras de cordón umbilical. Además, nuestros resultados son consistentes con los de otros estudios, que resaltan el papel crítico de TDO/IDO en el mantenimiento de un embarazo22,23. Nuestro estudio presentó la estimación de IDO, calculada mediante la fórmula [KYN]/[TRP]. Esta relación se ha utilizado para expresar cambios en la actividad de IDO en tejidos aislados o medios de cultivo38,39,40. Es importante señalar que este indicador no evalúa estrictamente la actividad enzimática in vivo, ya que no se consideran condiciones fisiológicas relevantes. En cambio, la relación KYN/TRP utilizada en nuestro estudio es un índice de diagnóstico fácil de calcular que representa el contenido real de ambas sustancias, que es la suma del suministro, metabolismo y excreción de TRP y KYN.

Otras proporciones, como la relación KYNA/KYN y la relación KYNA/TRP, demuestran cambios dinámicos en la proporción de metabolitos de KP en diferentes tejidos. Nuestro estudio encontró un aumento de la relación KYNA/KYN, un sustituto de la actividad de la quinurenina aminotransferasa (KAT), en el tejido del cordón umbilical, pero no en la placenta materna ni en las muestras de membrana fetal. Una posible explicación para este hallazgo es el aumento del metabolismo de los aminoácidos de las células madre mesenquimales del cordón umbilical humano, que es esencial para su función biológica y proliferación41. El estudio de Wang y sus colegas informó una alta expresión de la isoenzima KAT II en las células madre mesenquimales del cordón umbilical humano, que cataliza la conversión de KYN en KYNA42. Por lo tanto, la mayor proporción KYNA/KYN observada en la muestra de tejido del cordón umbilical en nuestro estudio puede atribuirse a las células madre mesenquimales. Se necesitan más estudios para confirmar estos resultados y comparar la actividad KAT y su expresión entre embarazos a término normal y condiciones o disfunciones patológicas como la preeclampsia o el estrés psicológico materno perinatal. Finalmente, encontramos una diferencia significativa en la relación KYNA/TRP, un marcador para la eliminación/excreción de metabolitos de quinurenina indicativos de enfermedad renal43, entre la placenta y la membrana fetal, pero no las muestras de cordón umbilical. La explicación de este fenómeno necesita ser fundamentada por más investigaciones. Especulamos que, en circunstancias fisiológicas, puede haber un equilibrio en el sistema placentario con respecto a la excreción de metabolitos de quinurenina. Por lo tanto, sería interesante comparar la excreción de metabolitos de quinurenina entre participantes embarazadas sanas y aquellas con afecciones médicas como preeclampsia o depresión perinatal.

Aunque nuestros resultados confirman la viabilidad del uso de LC-MS/MS para cuantificar TRP y otros metabolitos del triptófano en muestras de placenta materna, membrana fetal y cordón umbilical, se deben considerar varias limitaciones. Estos incluyen el pequeño tamaño de la muestra, la falta de comparación con tejidos obtenidos de pacientes con afecciones médicas como preeclampsia, depresión perinatal o estrés psicológico perinatal, y la falta de muestras de sangre umbilical o de sangre materna para realizar comparaciones adicionales. Debido a las condiciones de consentimiento del comité de ética, no se recogieron datos personales. Por lo tanto, nuestro análisis no incluye numerosos registros, incluidos la anestesia y el uso de otros fármacos durante el parto por cesárea electiva. Las cuestiones técnicas, como el límite de la cuantificación y el rendimiento del análisis, también deben considerarse limitaciones. Será necesario aumentar la sensibilidad del ensayo si las concentraciones de los metabolitos analizados son demasiado bajas. Se puede considerar la preparación automatizada de muestras para aumentar el rendimiento del análisis. Sin embargo, para un número pequeño de muestras, este rendimiento es satisfactorio. Otra limitación de este estudio fue la falta de una comparación con material genético para analizar la producción de enzimas relacionadas con la descomposición de TRP o una evaluación inmunohistológica de los receptores a los que se dirige KYNA y otros metabolitos de TRP en nuestro estudio.

En conclusión, demostramos que TRP y sus metabolitos se pueden medir de manera confiable en los tejidos fetoplacentarios. Hemos desarrollado un método LC-MS/MS altamente sensible y específico para cuantificar TRP, KYN y KYNA en muestras de cordón umbilical y placentario humano. El método demostró una buena reproducibilidad, con una precisión CV <10% y una precisión del 85-115%. Este estudio subraya la importancia de la cuantificación precisa de TRP, KYN y KYNA en muestras biológicas y la posible aplicación de este método en estudios futuros que investiguen la participación del KP en el desarrollo fetal. Además, encontramos una relación KYNA/KYN alta en el cordón umbilical, concentraciones altas de KYN y una relación KYN/TRP pero concentraciones bajas de KYNA en la placenta materna utilizando este método en material recolectado durante cesáreas realizadas en mujeres sanas.

Estudios futuros podrían investigar la relación entre el contenido de quinureninas y diversas características placentarias y fetales, como la edad gestacional, el peso al nacer y la salud materna. Teniendo en cuenta el mayor contenido de KYN en la placenta materna y el mayor contenido de KYNA en el compartimento fetal y los múltiples efectos biológicos ejercidos por KYN y KYNA, una mayor investigación de su papel en la placenta, incluida la síntesis, el metabolismo y la regulación, ayudaría a explicar su importancia para el desarrollo fetal. Nuestro método proporciona una herramienta valiosa para futuros estudios para comprender el papel de TRP y quinureninas en la salud placentaria y fetal y las condiciones médicas o psicológicas (es decir, depresión perinatal o estrés psicológico perinatal) durante el embarazo.

El siguiente es un estudio de investigación basado en métodos con una muestra pequeña de muestras de placenta humana recolectadas de forma anónima del Departamento de Obstetricia del Hospital Universitario de Mannheim, Alemania. Esta investigación tuvo como objetivo analizar las concentraciones de TRP, KYN y KYNA. Además, examinamos la relación KYN/TRP (que refleja la actividad IDO), la relación KYNA/KYN (que refleja la actividad KAT) y la relación KYNA/TRP de muestras de placenta humana, membranas fetales y cordón umbilical. Dado que las muestras fueron recolectadas de forma anónima, no hubo contacto con las participantes y las parteras proporcionaron información sobre la edad y el tiempo de gestación. El médico del estudio no tuvo contacto con los participantes. Finalmente, este estudio se realizó siguiendo la Declaración de Helsinki y aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Mannheim, Universidad de Heidelberg (2022-574).

Las placentas a término (n = 9) se recolectaron después de un parto por cesárea electiva entre las semanas 38 y 40 de gestación. Todas las participantes que se sometieron a un parto por cesárea estaban médicamente estables, sin ninguna condición médica, programadas para el procedimiento quirúrgico, tenían experiencia previa en parto por cesárea y no tenían indicaciones médicas o de emergencia. Se obtuvieron muestras de placenta materna, membranas fetales y cordones umbilicales inmediatamente después del nacimiento y se diseccionaron. Se excluyeron del estudio las placentas maternas de pacientes que se sometieron a procedimientos de emergencia y estaban en estado crítico o tenían alguna enfermedad médica u obstétrica (incluida la muerte fetal).

Después de la disección de la estructura placentaria, las muestras biológicas se almacenaron inmediatamente en hielo seco para su transporte hasta su almacenamiento en un centro de investigación del Instituto Central de Salud Mental de Mannheim (Alemania). Las muestras se enviaron en hielo seco a las instalaciones de investigación del Departamento de Bioanálisis de la Universidad de Lublin, Polonia, para su posterior análisis.

Los estándares analíticos marcados con isótopos estables de TRP [13C11, 15N2], KYN [13C6] y KYNA [2H5] se adquirieron de Alsachim (Illkirch-Graffenstaden, Francia). El acetonitrilo y el metanol de grado Optima® LC/MS se obtuvieron de Fisher Chemical (Waltham, MA, EE. UU.) para su uso en análisis LC/MS. El ácido fórmico (grado LC/MS) y el etanol (grado LC/MS) se obtuvieron de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). El agua ultrapura se adquirió del sistema de purificación Millipore Direct-Q3-UV (Merck KGaA, Alemania). Los filtros de jeringa Titan RC, 0,2 μm fueron suministrados por Thermo Scientific (Waltham, MA, EE. UU.).

Se prepararon estándares analíticos marcados con isótopos estables de TRP [13C11, 15N2], KYN [13C6] y KYNA [2H5] como soluciones madre a una concentración de 1000 mg/L según las especificaciones. Se prepararon soluciones de trabajo de estándar interno en metanol.

Para la preparación de muestras, se recolectaron placentas, membranas fetales y cordones umbilicales de los sujetos del estudio después de una cesárea y se almacenaron a -80 °C. Se pesaron 0,2 g de cada muestra en un tubo de centrífuga de plástico de 2 ml y se homogeneizaron en agua ultrapura (1:3 p/v) utilizando un homogeneizador de bolas de laboratorio (Bead Mill MAX, VWR, parte de Avantor, Radnor PA, Estados Unidos). La desintegración se realizó utilizando bolas de cerámica de 2,8 mm de diámetro a 6 m/s durante un ciclo de 30 s. Después de la centrifugación a 20,598 × g durante 10 min a 4 °C, se agregaron 25 µL de la solución de trabajo de estándares internos marcados isotópicamente: TRP [13C11, 15N2], KYN [13C6] y KYNA [2H5] a 200 µL del suspensión homogeneizada. Las muestras se agitaron con 575 µl de metanol/etanol enfriado (1:1 v/v) durante 5 minutos, se colocaron a -20 °C durante 15 minutos y luego se centrifugaron durante 10 minutos. El sobrenadante resultante se transfirió a un nuevo tubo de centrífuga, se añadió metanol (1:1 p/v), y las muestras se agitaron y se colocaron a -20 °C durante 60 min antes de centrifugarse a 12.100 x g durante 20 min a 4 °C. Los sobrenadantes se diluyeron con agua ultrapura (1:1 p/v) y se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,2 µm en viales de muestreador automático.

La determinación de TRP, KYN y KYNA se realizó utilizando un cromatógrafo líquido de la serie 1290 Infinity II de Agilent Technology acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo de Agilent Technologies 6475 QQQ LC/MS equipado con una fuente de iones Jet Stream. La cromatografía se llevó a cabo en una columna Zorbax Extend C18 RRHD (2,1 × 100 mm, 1,8 µm) con una columna protectora Zorbax Eclipse Plus C18 UHPLC (2,1 × 5 mm, 1,8 µm) y un gradiente de ácido fórmico al 0,1% en agua y Ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo a un caudal de 0,5 ml/min. El programa de gradiente fue el siguiente: 0–1 min, 3% B; 1 a 8 min, 3%-35% B; 8–8,01 min, 35–95% B; 8,01–11 min, 95 % B y luego 3 min de acondicionamiento de la columna al 3 % B. La columna y el muestreador automático se mantuvieron a 40 °C y 10 °C, respectivamente. El instrumento LC/QQQ se operó en modo de ionización por electropulverización positiva (ESI) y tipo de escaneo de monitoreo dinámico de reacciones múltiples (dMRM). Los parámetros de la fuente de iones MS se establecieron de la siguiente manera: temperatura del gas de secado 250 °C; flujo de gas de secado 11 L/min; presión del nebulizador 45 psi; temperatura del gas envolvente 200 °C; flujo de gas envolvente de 6 L/min y voltaje capilar de 2750 V. Las transiciones MRM, las energías de colisión (CE) y los fragmentos o voltajes para todos los compuestos objetivo se presentan en la Tabla 1 y en la Fig. 1. Se utilizó el software de adquisición de datos Mass Hunter de Agilent para controlar el Se aplicaron equipos, Mass Hunter Quantitative QQQ Analysis B.10.2 y el software Qualitative Analysis B.10.00 para el procesamiento de datos.

La relación KYN/TRP que representa la actividad IDO se calculó usando la siguiente fórmula: [KYN]/[TRP]. La relación KYNA/KYN, que representa la conversión enzimática de KYN a KYNA (considerada como actividad KAT), se calculó utilizando la siguiente fórmula: [KYNA]/[KYN]. Finalmente, utilizamos los datos obtenidos para calcular la relación KYNA/TRP, que sirve como biomarcador para evaluar la excreción de metabolitos en KP43.

Todas las variables numéricas se presentaron como media ± error estándar de la media -SEM-). Los datos que siguieron una distribución gaussiana se evaluaron mediante ANOVA unidireccional para evaluar la importancia de las diferencias entre los grupos. La prueba de Tukey para comparaciones múltiples se utilizó como análisis post hoc si se encontraba una diferencia significativa. Los datos con una distribución no gaussiana se evaluaron utilizando el Kruskal-Wallis (ANOVA no paramétrico) seguido de la prueba de comparaciones múltiples post hoc de Dunn si se encontraba una diferencia significativa. Se calcularon valores de p ajustados para estas diferencias. Este estudio definió significación estadística siempre que el valor p de dos colas fuera menor o igual a 0,05. Para los análisis estadísticos y los datos descriptivos se utilizó el software jamovi 2.0.044 basado en R. Los gráficos se generaron utilizando Prism 8 GraphPad (GraphPad Software Inc., California, Estados Unidos de América).

Dado que las muestras fueron recolectadas de forma anónima, no hubo contacto con las participantes y las parteras proporcionaron información sobre la edad y los tiempos de gestación. El médico del estudio no tuvo contacto con los participantes. Como utilizamos exclusivamente datos anónimos de los pacientes, el consentimiento individual del paciente no fue necesario ni posible. El protocolo del estudio y todos los procedimientos del estudio fueron revisados ​​y aprobados por el comité de ética de la Facultad de Medicina de Mannheim. . Además, este estudio de viabilidad se realizó de acuerdo con los principios descritos en la Declaración de Helsinki para muestras no identificables. Además, se adhirió a las definiciones de materiales biológicos no identificables establecidas por el Comité de Ministros de los Estados miembros sobre la investigación de materiales biológicos de origen humano del Consejo de Europa (958ª reunión de los Ministros Adjuntos).

Respecto al consentimiento informado, quisiéramos aclarar que al ser las muestras recolectadas de forma anónima y, en consecuencia, no identificables, no hubo contacto con los participantes. El médico del estudio obtuvo placentas frescas inmediatamente después del nacimiento en la sala de procedimientos y laboratorio del Departamento de Obstetricia del Hospital Universitario de Mannheim. Las parteras proporcionaron información sobre la edad y el tiempo de gestación sin nombres ni otros datos identificables. El médico del estudio no tuvo contacto con los participantes. Como solo utilizamos datos anónimos de los pacientes y no realizamos análisis genéticos en las muestras de placenta, el consentimiento individual del paciente no fue necesario ni posible. Esta declaración y el protocolo del estudio recibieron la aprobación del Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Mannheim, que renunció a la necesidad de consentimiento informado. El Comité de Ética II de la Universidad Ruprecht-Karls de Heidelberg (Facultad de Medicina de Mannheim) examinó el proyecto de investigación (574-22) desde un punto de vista ético y legal y no planteó ninguna preocupación sobre su implementación. Como el biomaterial obtenido a través de material residual es considerado seudónimo, el Comité de Ética concedió el estudio sin consentimiento informado porque no se realizan análisis genéticos y no se utilizan datos de identificación personal. En consecuencia, estaba prohibido contactar al donante de órganos o acceder a los registros médicos para obtener medicamentos o información relacionada con el paciente. Además, el Comité de Ética restringió el contacto entre los participantes y los miembros del equipo de estudio. Por último, el material se recogió directamente del laboratorio del Departamento de Ginecología y Obstetricia del Hospital Universitario de Mannheim y fue entregado por las parteras del hospital. El comité proporcionó las siguientes instrucciones, que se cumplieron estrictamente: (1) el proyecto es un estudio de viabilidad/estudio de métodos utilizando material residual para el establecimiento de un método de laboratorio, y (2) como no se planearon estudios genéticos, el biomaterial podría considerarse como máximo un seudónimo. Al finalizar, el biomaterial fue destruido.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio no son de acceso público debido a la ley de protección de datos aplicable del estado federado de Baden-Württemberg, pero están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud justificada.

Receptor de hidrocarburos arilo

Análisis de variación

Variación del coeficiente

Monitoreo dinámico de reacciones múltiples

Ionización por electropulverización

Receptor 35 acoplado a proteína G

Receptor 127 acoplado a proteína G

Receptor acoplado a proteína G 142

Indolamina 2,3-dioxigenasa

Quinurenina aminotransferasa

Vía de la quinurenina

quinurenina

ácido quinurénico

Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem

Límite más bajo de cuantificación

Diferencia significativa

Nicotinamida adenina dinucleótida

N-metil-D-aspartato

Triptófano 2,3-dioxigenasa

triptófano

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Descargar referencias

Los autores de este estudio desean agradecer al Departamento de Ginecología y Obstetricia del Hospital Universitario de Mannheim (Director: Prof. Dr. Sütterlin); Un agradecimiento especial a la Dra. Christiane Otto, quien nos ayudó con la accesibilidad de las muestras de placenta. Esta investigación fue apoyada parcialmente por el Ministerio de Educación y Ciencia de Polonia, dentro de la actividad estatutaria de la Universidad Médica de Lublin (Proyecto No. DS 670/2023 otorgado a EF).

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Estos autores contribuyeron por igual y compartieron la primera autoría: Bruno Pedraz-Petrozzi y Marta Marszalek-Grabska.

Departamento de Psiquiatría y Psicoterapia, Instituto Central de Salud Mental, Facultad de Medicina de Mannheim, Universidad de Heidelberg, J5, 68159, Mannheim, Alemania

Bruno Pedraz-Petrozzi, Eva Kathryn Lamade, María Gilles y Michael Deuschle

Departamento de Farmacología Clínica y Experimental, Universidad Médica de Lublin, Jaczewskiego 8b, 20-090, Lublin, Polonia

Marta Marszalek-Grabska y Waldemar A. Turski

Departamento de Bioanálisis, Universidad Médica de Lublin, Jaczewskiego 8b, 20-090, Lublin, Polonia

Anna Kozub, Klaudia Szalaj, Alicja Trzpil, Anna Stachniuk y Emilia Fornal

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BP-P.: Idea, conceptualización, curación de datos, análisis formal, redacción: borrador original, visualización. MM-G.: Idea, conceptualización, curación de datos, análisis formal, redacción: borrador original, visualización. AK: preparación de muestras, análisis LC/MS. KS: preparación de muestras. AT: Análisis LC/MS, procesamiento de datos. AS: procesamiento de datos. EKL: conceptualización, redacción, revisión y edición. MG: Escritura: revisión y edición. MD: conceptualización, redacción: revisión y edición, supervisión, administración de proyectos. WAT: conceptualización, redacción: revisión y edición, supervisión. EF: Metodología LC/MS, supervisión, financiación, procesamiento de datos, redacción, revisión y edición. BP-P. y MM-G compartió la primera autoría de este artículo.

Correspondencia con Bruno Pedraz-Petrozzi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Pedraz-Petrozzi, B., Marszalek-Grabska, M., Kozub, A. et al. Cuantificación basada en LC-MS/MS de triptófano, quinurenina y ácido quinurénico en muestras de placenta humana, membranas fetales y cordón umbilical. Representante científico 13, 12554 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39774-3

Descargar cita

Recibido: 27 de marzo de 2023

Aceptado: 31 de julio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39774-3

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