El microambiente tumoral líquido mejora la vía de señalización WNT de la metástasis peritoneal del cáncer gástrico

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11125 (2023) Citar este artículo

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El cáncer gástrico sigue siendo uno de los tumores más prevalentes en todo el mundo y la metástasis peritoneal es responsable de aproximadamente el 60% de las muertes en pacientes con cáncer gástrico avanzado. Sin embargo, el mecanismo subyacente de la metástasis peritoneal no se conoce bien. Hemos establecido organoides derivados de ascitis maligna (MA) de pacientes con cáncer gástrico y notamos que el sobrenadante de MA podría aumentar fuertemente la formación de colonias de organoides. Por lo tanto, nos dimos cuenta de que la interacción entre las células cancerosas exfoliadas (CEC) y el microambiente tumoral líquido contribuye a la metástasis peritoneal. Además, diseñamos una prueba de control de componentes medios que demostró que los exosomas derivados de MA no podían mejorar el crecimiento de organoides. Utilizando inmunofluorescencia e imágenes confocales, así como un ensayo indicador de luciferasa dual, nuestros datos mostraron que la vía de señalización de WNT estaba regulada positivamente por altas concentraciones de ligandos de WNT (wnt3a y wnt5a), lo cual fue verificado mediante ELISA. Además, la supresión de la vía de señalización WNT disminuyó la función promotora del crecimiento del sobrenadante de MA. Este resultado implicó a la vía de señalización WNT como un objetivo terapéutico potencial para la metástasis peritoneal del cáncer gástrico.

La metástasis es la principal causa de muerte en pacientes con cáncer. En particular, la metástasis peritoneal es responsable de aproximadamente el 60% de las muertes en pacientes con cáncer gástrico avanzado1. La ascitis maligna (AM), como uno de los síntomas más comunes de los pacientes con cáncer gástrico avanzado, predice un pronóstico adverso.

La aparición de metástasis de implantación implica la diseminación de CEC y la formación de nichos premetastásicos. La transición mesotelial-mesenquimatosa (MMT) se considera la clave de una serie de cambios patológicos2.

MA es un microambiente tumoral hipóxico, inflamatorio e inmunosupresor, compuesto por quimiocinas de citocinas complejas, factores de crecimiento, exosomas y varias células en suspensión, como células mesoteliales tumorales y células inmunitarias. Sin embargo, la interacción entre las CEC y el microambiente tumoral, como la evitación de anoikis, aún no se comprende bien.

Hasta ahora, se han establecido líneas de organoides derivadas de diversos tipos de tumores y han demostrado una alta consistencia en la herencia biológica3. Una gran cantidad de investigaciones destinadas a verificar la viabilidad de que los organoides se empleen para la detección individualizada de medicamentos, se realizaron uno tras otro al comienzo del piloto4,5,6. La importancia del microambiente tumoral en la génesis y progresión del tumor se reconoce a medida que avanza la investigación. El estroma tumoral, incluidas las células inmunitarias, se ha llevado al sistema de cultivo organoide para imitar el microambiente del tumor7,8.

Ya se han descrito organoides que modelan unidades gástricas normales y cáncer gástrico9. Usando un protocolo similar, establecimos organoides derivados de MA de pacientes con cáncer gástrico y notamos que el sobrenadante de MA podría aumentar fuertemente la formación de colonias de organoides derivados de ascitis maligna (MADO)10. Consideramos la heterogeneidad tanto entre el cáncer gástrico primario como las CEC, así como sus microambientes discrepantes, que causaron que se produjera este fenómeno. De hecho, la diversidad del espectro de mutaciones entre tumores primarios y CEC en MA se ha informado anteriormente11.

Por lo tanto, nos propusimos determinar cómo el microambiente MA mejora los comportamientos biológicos malignos de las CEC. Aquí mostramos que hay altos niveles de ligandos WNT (wnt3a y wnt5a) en el sobrenadante de ascitis, que regulan positivamente la vía de señalización de WNT.

MA se obtuvo de pacientes con cáncer gástrico sometidos a paracentesis paliativa. Todos estos casos fueron confirmados patológicamente como adenocarcinoma gástrico mediante cirugía o biopsia endoscópica, y se confirmó que sus ascitis contenían células tumorales mediante citología de capa fina en base líquida. Todos los pacientes involucrados firmaron un consentimiento informado. Todas las recolecciones y experimentos de tejido se realizaron en estricta conformidad con las pautas de la Declaración de Helsinki (2013) y fueron aprobadas por el comité de ética local (Comité de Ética de la Medicina, Universidad Médica de la Marina, PLA). Los documentos de ética específicos se pueden encontrar electrónicamente en la sección Archivos relacionados de este artículo.

El drenaje por punción abdominal se realizó clínicamente y la ascitis en la bolsa de drenaje se recogió en una botella seca estéril de aproximadamente 200 ml. Todas estas muestras fueron transportadas al laboratorio a una temperatura de 4 °C, mientras que el tratamiento experimental se llevó a cabo dentro de las 6 h.

A su llegada, el MA se filtró con una membrana de 70 μm para eliminar las suspensiones sólidas. Luego se centrifugó MA a 1200 rpm durante 5 minutos para enriquecer las CEE. El sobrenadante se incubó a 56 °C durante 30 min y se filtró con membrana de 0,22 μm después de centrifugarse a 3000 rpm durante 10 min. Mientras tanto, se recogieron CEE enriquecidas y se sembraron en Matrigel con factor de crecimiento reducido (Corning 356,231) en una placa de cultivo celular de 24 pocillos precalentada (Costar, 3524) con 400 grupos de células o 1000-2000 células individuales en un pocillo. Se agregaron 500 μl de medio de cultivo MADO (Tabla complementaria 1) o la mezcla de sobrenadante anterior y medio de cultivo MADO a cada pocillo y las placas se transfirieron a incubadoras a 37 °C/5% de CO2.

El medio se renovó cada tres días. Hacemos observaciones continuas de MADO y tomamos fotografías cuando corresponde. El pase de MADO se realizó esencialmente como lo describen Jie Li et al.10. Específicamente, los MADO se retiraron del Matrigel, se disociaron mecánicamente en pequeños fragmentos y se transfirieron a Matrigel nuevo con medio de cultivo nuevo como se describió anteriormente.

La proliferación/crecimiento celular se evaluó mediante ensayos CCK8 (HY-K0301, MCE) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron por triplicado en placas de 96 pocillos a una densidad de 100 grupos de células/10 µl de Matrigel como se describió anteriormente. Se añadió solución de tinte (DMEM/F12: kit CCK-8 = 10:1) en los momentos indicados (día 1, día 3, día 6 y día 9) y las placas se incubaron a 37 °C durante 1 h. antes de que se detectara la absorbancia a 450 nm. Cada prueba se realizó por triplicado. Posteriormente se renovaron los medios de cultivo.

Para WB, las células se recogieron y se lisaron en tampón RIPA (Cell Signaling) con un cóctel inhibidor de proteasa completo (Roche), inhibidores de fosfatasa (Roche) y PMSF (Sigma), luego se centrifugaron a 12.000 g durante 10 minutos a 4 °C. La concentración de proteína se midió con el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad (Hercules, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ensayos de transferencia Western se realizaron como se describió anteriormente12. Los anticuerpos primarios se obtuvieron de la siguiente manera: anti-caspasa-3, anti-PCNA, anti-β-catenina, anti-β-catenina no fosfo (activa) y anticuerpo del kit de muestra de anticuerpos marcadores exosomales (Flotillin-1 y EpCAM) de Cell Signaling Technology, anticuerpo anti-β-actina de Abmart.

El sobrenadante recogido anteriormente se centrifugó a 20.000 xg durante 30 minutos a 4 °C para eliminar las células desprendidas. Luego, el sobrenadante se centrifugó a 150.000 xg durante 2 h a 4 °C para eliminar los restos celulares. El precipitado gelatinoso transparente se resuspendió en PBS frío y luego se repitió el último paso anterior para un mayor refinamiento. Para el ensayo de proteínas, se añadió tampón RIPA 10 × que contenía PMSF al 10% e inhibidores de fosfatasa a la fracción del exosoma, se incubó en hielo durante 15 minutos y se aplicó al sistema de ensayo de proteínas micro BCA (ThermoFisher Scientific).

Las muestras de exosomas se tiñeron negativamente como se describió anteriormente13. Se trató hidrófilamente una rejilla de cobre de malla 400 recubierta con películas de formvar/carbono. La suspensión de exosomas (5 a 10 µl) se colocó en Parafilm y la rejilla se hizo flotar sobre el líquido del exosoma y se dejó durante 15 minutos. La muestra se tiñó negativamente con una solución de acetato de uranilo al 2% durante 2 minutos. Los exosomas en la rejilla se visualizaron con un aumento de 40.000 veces con un microscopio electrónico de transmisión H-7650 (Hitachi, Tokio, Japón) en el Laboratorio Central de Investigación de la Segunda Universidad Médica Militar.

Los MADO se cultivaron en placas de Petri confocales con fondo de vidrio de 35 mm (BIO-IMAG). La inmunofluorescencia y las imágenes confocales se realizaron como se describió anteriormente14. Después de crecer hasta una densidad adecuada, las células se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,5%, se bloquearon con PBS que contenía suero de cabra al 10% y se incubaron durante la noche con anticuerpos a 4 °C. Las placas fijadas y teñidas se lavaron 3 veces con PBS y los anticuerpos primarios se marcaron mediante incubación con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor (Invitrogen). Luego, las placas se montaron con un medio de montaje que contenía DAPI (Prolong Gold Antifade Reagent, Life Technologies) y las células se visualizaron con microscopía láser confocal (Carl Zeiss).

El ensayo indicador de luciferasa dual se realizó como se describió anteriormente15. Específicamente, se sembraron células MGC-803 en placas de 24 pocillos que contenían medio PDO y medio MA. Luego, las células se cotransfectaron con plásmidos TOP después de cultivarlas durante tres días. Las células se recolectaron 24 h después de la transfección y las actividades de luciferasa se analizaron mediante el kit de ensayo indicador de luciferasa dual (Beyotime, RG027). La actividad del reportero se normalizó con respecto al control Renilla.

Después de subcultivar los MADO y expandir las células tumorales a un número suficiente, los fragmentos de MADO separados mecánicamente se mezclaron uniformemente con matrigel (Corning 356231) y se sembraron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos (Costar, 3516) con 100 grupos de células o 250–500. células individuales por pocillo. El ensayo de sensibilidad al fármaco se realizó cuando cada pocillo contenía aproximadamente 200 ± 50 MADO en 15 ml de matrigel con 300 ml de medio de cultivo. Se prepararon salinomicina (MCE, HY-15579) y inhibidor de puercoespín (Porcn-IN-1, MCE, HY-111472) en medio MADO según las diferentes concentraciones (dilución diez veces). Después de que los MADO crecieron en condiciones adecuadas, se añadió el medio preparado con concentraciones de gradiente de fármaco. Después de 3 días de tratamiento farmacológico, se renovó el medio que contenía el fármaco y se repitieron otros 3 días de tratamiento farmacológico. Luego se detectó la viabilidad celular de los MADO en cada pocillo. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, los MADO se trataron con Cell Counting Kit-8 (MCE, HY-K0301) y Cytation5 (BioTek) detectó el valor de DO de cada pocillo. Los valores de OD (densidad óptica) del grupo de dosificación y del grupo de control se convirtieron a la tasa de supervivencia de MADO en cada pocillo, y luego se usó Graphpad Prism8 para formar una curva de ajuste entre diferentes concentraciones de salinomicina (lg) y la tasa de supervivencia de MADO. Se calculó la mitad de la concentración inhibidora máxima (CI50) de salinomicina en MADO y se seleccionó una concentración de fármaco adecuada para el experimento de inhibición de la vía de señalización WNT. Cada prueba se realizó por triplicado. La concentración de Porcn-IN-1 está referida a las pautas del MCE (https://www.medchemexpress.cn/Porcupine-IN-1.html), 0,5 ± 0,2 nM, y finalmente elegimos la concentración adecuada del fármaco según la situación actual.

Durante el cultivo MADOs mencionado anteriormente, el sobrenadante del medio se recogió cada 3 días. Las muestras se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 minutos a 4 °C para eliminar cualquier componente celular potencial, y el medio se separó y almacenó a -80 °C en 2 h para su posterior análisis. Los niveles de Wnt-3a/Wnt-5a en muestras de medio se midieron utilizando kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) disponibles comercialmente, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (CUSABIO, CSB-EL026136HU/CSB-EL026138HU, Houston, EE. UU.). Todas las mediciones se realizaron por duplicado para cada muestra y se calculó el valor medio.

La intensidad de fluorescencia promedio de los MADO se midió utilizando ImageJ como se describió anteriormente16. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism GraphPad. Se utilizó ANOVA unidireccional para comparaciones multigrupo. Todos los valores se muestran como media ± error estándar de la media (sem). P ≤ 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Changhai de la Segunda Universidad Médica Militar (CHEC2016-157) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes o sus tutores.

Utilizando fotografías a intervalos, pudimos describir cambios en un solo organoide. El sobrenadante de MA aumentó significativamente la eficiencia de formación y el tamaño de los organoides al promover la división celular. Para descartar si la diferencia individual proviene de células tumorales o del microambiente tumoral, diseñamos una prueba de coincidencia cruzada en la que las líneas MADO se incubaron con sobrenadante de ascitis parental o no parental, respectivamente (Fig. 1A, B, Fig. 1 complementaria). Como se esperaba, el sobrenadante de ascitis tanto parental como no parental aumentó la formación de colonias de MADO. Nos preguntamos si el sobrenadante de MA tiene el mismo efecto en los MADO subcultivados. No es sorprendente que hayamos observado un aumento de la proliferación celular y la formación de colonias tanto en MADO primarios (P0) como en MADO subcultivados (P1) mediante el recuento del número de colonias en los ensayos CCK8 (Fig. 1C-F). Además, las células tumorales primarias difícilmente forman organoides sin sobrenadante de MA, mientras que el sobrenadante de MA parece afectar solo la tasa de crecimiento de los MADO P1. Curiosamente, notamos que tanto la proliferación como la apoptosis de los MADO aumentaron cuando fueron estimulados por el sobrenadante de MA (Fig. 1G). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que existe una sustancia común que contribuye a los efectos de promoción del crecimiento en los MADO en la ascitis.

Tanto el sobrenadante de ascitis parental como el no parental promueven el crecimiento de MADO. (A) Imágenes representativas de campo brillante de una línea organoide, que se derivó de un paciente (P1) con carcinoma gástrico, lo que indica que el crecimiento de MADO aumentó al agregar la proporción indicada de sobrenadante derivado de ascitis parental (A1: 25 %, 50 %) o la contraparte de otro paciente (P2) (A2: 25 %, 50 %). Barra de escala, 100 μm. (B) Histograma que presenta el área de crecimiento de los MADO tratados anteriormente (día 9). Los datos indicaron media ± DE y se analizaron mediante la prueba t de Student (**p < 0,01; ***p < 0,001). (C) Imágenes representativas del cultivo primario (P0) y subcultivo (P1) de MADO tomadas con Agilent BioTek Cytation, tratadas con medios PDO o medios que contienen 25% de sobrenadante de ascitis. Barra de escala, 2000 μm. (D,E) Proliferación de MADO P0 y P1 según lo determinado por ensayos CCK8. (F) Recuento del número de colonias de MADO P0 y P1 anteriores. (G) Análisis de transferencia Western de Caspasa-3 y PCNA en MADO anteriores (día 9).

Además de varias células suspendidas, como células mesoteliales y células inmunitarias, citocinas complejas, quimiocinas, factores de crecimiento y exosomas constituyen el entorno extracelular de las CEE. Para determinar si los exosomas mejoran directamente el crecimiento de los MADO, purificamos los exosomas de MA mediante el método de ultracentrifugación aprovechando y mejorando el método informado por Yanting Hu13. La microscopía electrónica de transmisión mostró que la distribución de tamaño de los exosomas purificados estaba entre 40 y 100 nm con morfología discal clásica (Figura complementaria 2). Además, el análisis de transferencia Western de proteínas extraídas de exosomas reveló la presencia de marcadores de exosomas específicos (Flotillin-1 y EpCAM). En conjunto, estos resultados indicaron que el contenido principal de las microvesículas purificadas eran exosomas.

Para descartar la desviación probablemente causada por la disfunción biológica de los exosomas durante el proceso de extracción, realizamos una prueba de control de componentes del medio en la que los MADO fueron estimulados por los exosomas, el sobrenadante de MA parental (25% aquí) y la parte restante del sobrenadante de MA. Observamos que los exosomas no tuvieron un efecto significativo sobre el crecimiento de los MADO. Por el contrario, el grupo restante promovió fuertemente el crecimiento de los MADO, que estuvo muy cerca del grupo MA (Fig. 2). Esta prueba demostró que los exosomas no pueden mejorar directamente el crecimiento de los MADO, es decir, las sustancias que contribuyen a los efectos de promoción del crecimiento de los MADO en la ascitis existen en el sobrenadante de MA en lugar de los exosomas.

El exosoma derivado de la ascitis no puede promover el crecimiento de MADO. (A) Imágenes representativas de campo brillante de un MADO tratado con sobrenadante de ascitis (A), exosoma aislado del mismo y doble volumen de ascitis (1xE, 2xE) y la parte restante de la ascitis (R). Barra de escala, 210 μm. (B) Histograma que presenta el área de crecimiento de los MADO tratados anteriormente. (C) Histograma que presenta los diámetros de un solo MADO tratado anteriormente. Los datos indicaron media ± DE y se analizaron mediante la prueba t de Student (*p < 0,05; **p < 0,01; NS p > 0,05).

Para determinar el efecto de promoción del crecimiento producido a través de qué vía de señalización, utilizamos ensayos de transferencia Western para probar niveles clave de expresión de proteínas de varias líneas celulares de cáncer gástrico (Figura complementaria 4). Detectamos niveles elevados de β-catenina no fosfo, también conocida como β-catenina activa en la vía de señalización WNT, después de ser estimulada por el sobrenadante de MA (Figura complementaria 3). Mientras tanto, el nivel de expresión total de β-catenina se mantuvo igual después del tratamiento. Este resultado sugirió que la señalización WNT canónica de las líneas celulares de cáncer gástrico está regulada positivamente cuando fueron estimuladas por el sobrenadante de MA.

Para abordar aún más el mismo efecto en los MADO, detectamos el nivel de expresión de β-catenina no fosfo antes y después del tratamiento. Empleamos un método semicuantitativo para analizar la intensidad de la señal de fluorescencia (Fig. 3). Como se esperaba, tanto el grupo MA (M) como el grupo restante (R) mostraron una señal de fluorescencia más alta después del tratamiento, excepto el grupo exosoma (E).

El sobrenadante de ascitis aumentó la señalización de β-catenina activa. (A) Inmunofluorescencia para la localización de β-catenina activa en MADO tratados con sobrenadante de ascitis (A), exosoma aislado del mismo volumen de ascitis (E) y la parte restante de la ascitis (R). Barra de escala, 100 μm. (B) Gráficos de dispersión estadísticos que presentan la intensidad de fluorescencia promedio de los MADO tratados anteriormente. Los datos indicaron media ± DE y se analizaron mediante la prueba t de Student (**p < 0,01; NS p > 0,05). (C) Histograma que presenta la actividad luciferasa relativa del reportero Topflash en células AGS-803. Los datos indicaron media ± DE y se analizaron mediante la prueba t de Student (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; NS p > 0,05).

Después de ser estimulado por MA, la activación de la señalización de Wnt/β-catenina en MGC-803 se evidenció aún más por la alta actividad luciferasa del reportero topflash (Fig. 3C). En resumen, estos resultados indicaron que la vía de señalización WNT en MADO se activa después de ser estimulada por el sobrenadante de MA.

Detectamos la concentración de wnt3a y wnt5a tanto en medios PDO como en medios que contienen 25% de sobrenadante de MA en los puntos de tiempo indicados (Figs. 1C, 4A, B, Tabla S2). Descubrimos que el nivel de wnt3a y wnt5a en el sobrenadante de MA era aproximadamente 13 y 15,8 veces mayor que el del medio PDO. Curiosamente, wnt3a/wnt5a en los medios de cultivo disminuyó al principio y luego aumentó durante el cultivo de MADO, lo que indicó un nivel dinámico de wnt3a/wnt5a durante el cultivo de MADO.

La alta concentración de WNT en la ascitis promueve el crecimiento de MADO, que podría suprimirse bloqueando la señalización de WNT. (A,B) Los gráficos de líneas indican la concentración de wnts en los medios de cultivo durante el cultivo MADO P0 y P1 en los puntos de tiempo indicados (día 0, día 3, día 6 y día 9), medido con ELISA. El análisis estadístico demuestra diferencias significativas entre el grupo de medios PDO y el grupo de ascitis del 25% en cada punto de prueba. (C) Imágenes representativas de campo brillante de un MADO tratado con salinomicina (S), sobrenadante de ascitis (A), eliminando Wnt 3a/R-espondina 1 (- W/R). (D) Histograma que presenta el área de crecimiento de los MADO tratados anteriormente. Los datos indicaron media ± DE y se analizaron mediante la prueba t de Student (*p < 0,05; **p < 0,01).

Cuando se cultivaron MADO durante 12 días, la concentración de Wnt3a y Wnt5a en los medios de cultivo incluso superó la contraparte original (Figura complementaria 5A). Esta es una evidencia convincente de que la autocrina existe durante la cultura de los MADO. Luego utilizamos el inhibidor de Porcupine (Porcn-IN-1) para inhibir la secreción de Wnts en el día 9, cuando fue el punto de inflexión de los cambios de concentración. A pesar de que no hubo significación estadística, hubo una tendencia a la baja en Wnt3a y Wnt5a cuando Porcn-IN-1 estaba en una concentración de 5 nM (Fig. 5C, D complementaria). Sin embargo, notamos que hubo una disminución significativa en la proliferación (Figura complementaria 5B).

Para confirmar si la activación de la señal WNT conduce a la aceleración del crecimiento de los MADO, realizamos un ensayo de inhibición de la señal WNT para observar el crecimiento de los MADO. Aquí utilizamos salinomicina, que bloquea la fosforilación de LRP6 inducida por Wnt, para inhibir la señalización de Wnt/β-catenina. En primer lugar, realizamos un ensayo de sensibilidad al fármaco para confirmar la concentración adecuada del fármaco para los MADO. Con referencia al informe anterior, configuramos seis concentraciones de gradiente (100 uM, 10 uM, 1 uM, 0,1 uM y 0,01 uM) para probar la respuesta de cuatro MADO candidatos17. Luego se generaron e identificaron las curvas dosis-respuesta reproducibles y las concentraciones inhibidoras medio máximas (CI50) (Figura complementaria 6). Los valores de IC50 oscilan entre 0,024 y 0,1971 uM y se eligió el valor máximo (aquí 0,2 uM) para probar la respuesta de los MADO.

Como se esperaba, el crecimiento de MADO se inhibió tanto si se trataron con el inhibidor de WNT Salinomicina como si se cultivaron bajo abstinencia de Wnt. Notamos que el efecto de aceleración aportado por el sobrenadante de MA se eliminó cuando se bloqueó la señal WNT. Sin embargo, la inhibición del crecimiento causada por la eliminación de Wnt fue revertida por el sobrenadante de MA (Fig. 4C, D). En conjunto, estos datos indicaron que el sobrenadante de MA promueve fuertemente el crecimiento de MADO mediante la activación de la vía de señalización WNT.

El fenómeno que encontramos durante la optimización de la condición de cultivo MADO sugiere que el nicho artificial actual es insuficiente para simular el microambiente de las CEE. Lo primero que debemos averiguar es si el efecto promotor del crecimiento es específico o no, es decir, si el efecto existe sólo entre las CEE y el sobrenadante de ascitis de los padres. A través de la prueba de compatibilidad cruzada, encontramos que el sobrenadante de ascitis tanto parental como no parental promovió el crecimiento de MADO. Además, el sobrenadante de MA podría promover fuertemente el crecimiento de MADO subcultivados. En conjunto, estos datos indicaron que la promoción del crecimiento del sobrenadante de MA en MADO es universal. Notamos que las células tumorales primarias dependían más del sobrenadante de MA que los MADO subcultivados. Esto puede estar asociado con diferencias entre las células tumorales primarias y las estructuras organoides.

Además del complejo cóctel de citocinas, en la ascitis se suspenden abundantes exosomas. En vista de la tecnología madura de extracción de exosomas, primero probamos el exosoma para verificar si es el agente iniciador. El resultado mostró que los exosomas no pueden mejorar directamente el crecimiento de los MADO. Curiosamente, notamos que los exosomas conducen a un cambio morfológico de los MADO, pasando de una morfología esférica a una suelta. Yanting Hu et al. demostraron que los exosomas malignos derivados de ascitis de pacientes con GC promueven la diseminación de células tumorales peritoneales mediante la promoción de la señalización EMT13. Estos datos indicaron que los exosomas en la ascitis promueven principalmente la diseminación de células tumorales peritoneales en lugar de la proliferación.

A diferencia del tejido normal paracarcinoma al tejido tumoral, el MA carece del contraste correspondiente. Estudios anteriores intentaron encontrar marcadores proteicos comparando la MA con otros tipos de ascitis, como la cirrosis ascítica18. Este método no es adecuado para la selección de diferencias debido al enorme error causado por las diferencias individuales.

Por lo tanto, nos propusimos investigar desde abajo para dilucidar el mecanismo subyacente. En vista del largo período y el alto costo de realizar análisis de transferencia Western en organoides, utilizamos varias líneas celulares (SNU5, SNU16, AGS, MKN28 y MGC803) para probar una serie de proteínas clave de varias vías de señalización clásicas relacionadas con la proliferación, como β -catenina, mTor, p-Stat3, p-ERK. Los resultados mostraron que la señalización canónica de Wnt/β-Catenina se activó después de ser estimulada por el sobrenadante de ascitis. Además, demostramos que el sobrenadante de MA reguló positivamente la vía de señalización WNT de los MADO. ELISA validó niveles más altos de ligandos WNT (wnt3a y wnt5a) en el sobrenadante de MA que en el medio PDO.

Recientemente se ha debatido ampliamente que los Wnt activan la vía de señalización WNT de forma autocrina19,20. Aquí demostramos que existen ligandos WNT autocrinos durante el cultivo de MADO. Esto podría contribuir, al menos en parte, a la alta concentración de ligandos WNT en MA. También notamos la tendencia a la baja de las concentraciones de Wnts y los efectos de inhibición del crecimiento cuando se usó el inhibidor Porcupine. Esto ilustró el importante papel de los ligandos wnt en MA desde la perspectiva de los estados de crecimiento celular. También vale la pena mencionar que el efecto del bloqueo de Porcupine podría subestimarse in vitro porque el sobrenadante de MA proporcionado fue fijado.

Considerando tanto la situación de crecimiento como los cambios en la concentración de ligandos WNT, suponemos dos etapas diferentes durante el cultivo MADO. En la etapa inicial, las células tumorales dependen de altas concentraciones de ligandos WNT para "lanzarse" y los ligandos WNT se consumen fuertemente durante este período. En la etapa tardía, los ligandos autocrinos de WNT aprovechan la ventaja a medida que aumentan las células tumorales y formadoras de esferas, mientras que los niveles altos de ligandos WNT inician una retroalimentación positiva para promover el crecimiento de MADO. Curiosamente, parece que las células tumorales primarias dependen de niveles más altos de WNT que los organoides. Esto puede correlacionarse con una mayor resistencia al entorno de ligandos bajos en WNT de los MADO mediante la formación de esferas y la evolución.

La cascada de transducción de señales WNT se conserva en la evolución y está relacionada con innumerables fenómenos biológicos. Roel Nusse et al.21 han descrito cómo controla las células madre y contribuye a las enfermedades. El agonista de la vía Wnt, la R-espondina, el factor de crecimiento epidérmico EGF y el inhibidor de BMP, Noggin, constituyen un nicho artificial para la autorrenovación in vitro de organoides. Seidlitz T, et al. observaron que el nivel de dependencia de la señal Wnt varía mucho en los organoides GC derivados de diferentes pacientes22. Nanki et al. Mecanismos descubiertos por los que los organoides GC adquieren un fenotipo independiente de Wnt, a saber, la autosecreción de Wnt, mutaciones de APC y la regulación epigenética de WRi23. Aquí, nuestro estudio complementó el importante papel de la señalización WNT en la metástasis peritoneal gástrica.

Aquí, nuestro estudio carece de detección de la mutación APC que puede resultar en la autoactivación de la vía de señalización WNT parece explicar las respuestas divergentes de los MADO al sobrenadante de MA.

En este estudio, hicimos una investigación preliminar sobre el mecanismo que hace que el sobrenadante de ascitis aumente la formación de colonias de MADO. Descubrimos que los exosomas no pueden mejorar directamente el crecimiento de los MADO. Por la presente, demostramos que las altas concentraciones de ligandos WNT en ascitis maligna regulan positivamente la activación de la vía de señalización Wnt/β-Catenina y además mostramos la viabilidad de apuntar a la vía de señalización WNT.

Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo/material complementario. Mayores consultas pueden dirigirse a los autores correspondientes.

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Descargar referencias

Agradecemos al profesor Lixing Zhan por brindar ayuda en el experimento biológico.

El presente estudio fue financiado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82072707), el programa de investigación científica de la Comisión Municipal de ciencia y tecnología de Shanghai (19411970700 y 20Y11909400), el Proyecto 234 del Hospital Changhai (2019YXK019 y 2020YXK029) y el programa de investigación científica. de la Comisión Municipal de Salud y Atención de Nantong (QB2021051).

Estos autores contribuyeron igualmente: Huawei Xu, Zhibin Hao y Yujie Wang.

Departamento de Oncología, Hospital Changhai, Universidad Médica Militar Naval, Shanghai, 200433, China

Huawei Xu, Zhibin Hao, Yujie Wang, Jie Li, Ling Chen, Xiaobo Peng y Xianbao Zhan

Departamento de Oncología, Hospital Popular de Tongzhou, Nantong, 226300, China

Huawei Xu y Binbin Qian

Investigación y desarrollo temprano, Haobai Biotechnology Inc, Shanghai, 200235, China

Deng Zhang

Departamento de Oncología, Hospital Afiliado de la Universidad de Nantong, Nantong, 226000, China

Ning Hua Yao

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HX: Diseño, análisis e interpretación de datos, redacción de manuscritos. ZH y YW: recopilación y análisis de datos. DZ: pruebas de sensibilidad a medicamentos. JL, LC, NY y BQ: Revisión del manuscrito. XZ y XP: Concepción y diseño, supervisión del estudio, análisis de datos y revisión del manuscrito. Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión enviada.

Correspondencia a Xiaobo Peng o Xianbao Zhan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Xu, H., Hao, Z., Wang, Y. et al. El microambiente tumoral líquido mejora la vía de señalización WNT de la metástasis peritoneal del cáncer gástrico. Representante científico 13, 11125 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38373-6

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Recibido: 19 de diciembre de 2022

Aceptado: 07 de julio de 2023

Publicado: 10 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38373-6

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