Detección de bacterias que degradan la quitina en el medio ambiente de Arabia Saudita y caracterización de la quitinasa más potente de Streptomyces variabilis Am1

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11723 (2023) Citar este artículo

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Se recuperaron cuarenta y seis aislamientos quitinolíticos prometedores durante un análisis de bacterias quitinolíticas en el entorno de Arabia Saudita. Los tres aislamientos principales pertenecían al género Streptomyces. Streptomyces variabilis Am1 fue capaz de excretar la mayor cantidad de quitinasas, alcanzando el máximo a las 84 h con 0.5% de extracto de levadura y fuente de nitrógeno y 2% de galactosa como fuente de carbono. La purificación de quitinasa mediante DEAE-celulosa y Sephadex G75 mejoró la actividad específica hasta 18,6 veces y la recuperación hasta el 23,8% y mostró una masa de 56 kDa. La catálisis óptima de la quitinasa purificada fue a 40 °C y pH 8 con alta termoestabilidad y estabilidad del pH como lo refleja un valor de temperatura del punto medio de 66,6 °C y estabilidad a pH 4–9. Los reactivos proteicos SDS, EDTA y EGTA inhibieron significativamente la enzima y la quitinasa quelada con EDTA restableció su actividad después de la adición de iones Fe2+, lo que sugiere un tipo de metalo-quitinasa con iones férricos como cofactores. La quitinasa ejerció una alta actividad antifúngica contra algunos hongos fitopatógenos. Curiosamente, los Streptomyces probados pudieron producir nanocubos de quitosano junto con quitosano a partir de la degradación de quitina, lo que puede ser un poder adicional en su actividad antifúngica en la naturaleza. Este trabajo también revela la importancia de los entornos inexplorados como un conjunto de microorganismos prometedores con aplicaciones biotecnológicas.

Uno de los biopolímeros más ricos que se encuentran en el mundo es la quitina. Consiste en N-acetil D-glucosaminas (NAG) conectadas por enlaces β-1,4-glucosídicos. Sostiene la capa protectora externa de muchos organismos, incluidos insectos, hongos y otros crustáceos1. Además, las cáscaras de huevos de nematodos como Globodera rostochiensis y Meloidogyne javanica están compuestas por 9 y 30% de quitina, respectivamente2. La quitina protege a estos organismos patógenos, parásitos y causantes de enfermedades, de condiciones ambientales extremas y de los mecanismos defensivos del huésped, facilitando así el parasitismo y la propagación de estos organismos a otros huéspedes y otras localidades. En cuanto a los hongos fitopatógenos, las pérdidas de cultivos podrían oscilar entre el 5% y el 25% en los países desarrollados, mientras que en los países no desarrollados las pérdidas de cultivos pueden alcanzar entre el 20% y el 50%3.

Las quitinasas son aquellas enzimas que descomponen la quitina hidrolizando los enlaces β-1,4-glucosídicos convirtiéndola en quitooligosacárido (COS), acción adicional de las quitobiasas que conduce a NAG. Dependiendo de su actividad, las quitinasas se pueden clasificar en subgrupos de exoquitasas y endoquitasas4. En general, las quitinasas tienen una masa molecular de 20 a 120 kDa5. Se encuentran dentro de los grupos glucósido hidrolasa (GH) GH18 y GH19. Se ha observado que mamíferos, hongos y bacterias albergan quitinasas de la familia GH18. Mientras que algunas bacterias y plantas superiores contienen quitinasas de la familia GH196.

Curiosamente, las quitinasas son producidas por todos los artrópodos, incluidas las especies patógenas y no patógenas, para desempeñar un papel importante en la ecdisis o el proceso de muda de la cutícula actual y ayudar en la producción de una nueva. Además, están presentes en las glándulas salivales de varios insectos para ser utilizados en la ruptura de la cutícula del huésped7. Además, varios hongos pueden producir quitinasas para ser utilizadas para su nutrición, morfogénesis, desarrollo y como mecanismo de defensa contra otros organismos que contienen quitina. Estas especies incluyen Saccharomyces cerevisiae y algunos hongos filamentosos como Trichoderma sp., Penicillium sp., Lecanicillium sp., Aspergillus sp., Stachybotrys sp. y Agaricus sp. Además, algunos nematodos como Caenorhabditis elegans producen quitinasa como forma de defensa contra las especies competitivas circundantes2.

Los insecticidas, fungicidas y nematicidas químicos son las principales herramientas para controlar estos patógenos. Sin embargo, debido a su impacto perjudicial sobre los animales, los seres humanos y el medio ambiente, se están introduciendo técnicas novedosas. Una de las estrategias más importantes es atacar estos patógenos con quitinasas producidas por bacterias como Bacillus, Pseudomonas, Enterobacter, Serratia y Streptomyces8.

El género Streptomyces es un productor común de varias enzimas hidrolíticas, incluidas las quitinasas. Se produjeron quitinasas con éxito a partir de Streptomyces venezuelae9, Streptomyces halstedii10, Streptomyces viridificans11, Streptomyces aureofaciens12, Streptomyces sp. ANU627713, Streptomyces sp. M-2014, Streptomyces sp. DA1115 y Streptomyces sp. S-8416. En cuanto a Streptomyces mutabilis, solo se comprobaron preliminarmente dos cepas para determinar la productividad de quitinasa junto con otros metabolitos mientras se estudiaban varios aislados de actinobacterias del Sahara argelino17 y actinobacterias endofíticas de las raíces de plantas nativas en Francia18. Además, la enzima quitinasa no se ha caracterizado completamente en Streptomyces mutabilis ni una sola vez.

La producción de quitinasas a partir de estos microorganismos no sólo se emplea en el control biológico de plagas sino que también se utiliza para diversos fines, incluidas aplicaciones biomédicas, industriales y ambientales. Además, brinda ayuda en cosmética y mejora del sabor. Por ejemplo, los desechos quitinosos de la industria alimentaria, como los caparazones de camarón y cangrejo, se degradan mediante quitinasas para obtener alimentos y piensos de alta calidad como el COS19.

Las quitinasas, como agente de biocontrol contra hongos fitopatógenos, inhibieron con éxito muchos hongos que causan enfermedades como Pestalotia theae, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea y Bipolaris oryzae, mostrando así actividad antimicrobiana20,21. El estudio actual cubre la producción verde de quitinasa a partir de fuentes bacterianas como Streptomyces variabilis como una herramienta potencial contra hongos fitopatógenos que amenazan los cultivos. Según nuestra información, esta es la primera investigación sobre la caracterización enzimática de la quitinasa de Streptomyces variabilis.

Durante un cribado de microorganismos quitinolíticos en el entorno terrestre de Arabia Saudita, obtuvimos más de cuarenta y seis aislados prometedores. La actividad quitinolítica sobre agar quitina se confirmó en el 21,2% de los aislados. El mayor número de aislamientos quitinolíticos (15%) se registró en muestras recolectadas de la región de la rizosfera de plantas naturales que crecen en el desierto de Nafud, Arabia Saudita. Los tres principales aislados, Nof21, Am1 y Bat2, se recuperaron de la región de las raíces de plantas silvestres que crecen en el desierto del Gran Nafud, el desierto de Dahna y el desierto del norte de Shaqra en Arabia Saudita, respectivamente. La recolección de muestras de suelo se realizó de septiembre a diciembre de 2021.

Las especies probadas de Streptomyces pudieron producir quitosano y nanocubos (NC) de quitosano a partir de la degradación de quitina (Fig. 1a-e). Curiosamente, durante la evaluación de la productividad enzimática entre los aislados positivos, aparecieron perlas características (Fig. 1 arriba a la izquierda) junto con el caldo de fermentación. Estas perlas se examinaron mediante SEM, lo que reveló la formación de quitosano y la formación de nanocristales de quitosano con quitosano en el caso de Bat2 y Am1 (Fig. 1c). Las NC de quitosano del aislado Am1 se caracterizaron por invaginaciones prominentes en sus centros. En términos de productividad de quitinasa, se seleccionó el aislado designado como Nof21 para completar el estudio actual.

Perlas características observadas dentro del caldo de fermentación después de 6 días de fermentación (parte superior izquierda del panel a, byc). El examen de las perlas bajo SEM declaró la formación de quitosano (punta de flecha blanca) y nanocubos de quitosano (punta de flecha roja), especialmente en el caso de la cepa Bat2 y la cepa Am1. El panel (d) representa el aflojamiento y la degradación de la quitina durante el curso de la degradación de la quitina por el aislado Am1, mientras que el panel (e) representa la quitina antes de la hidrólisis enzimática.

Con respecto a la producción de quitinasa, los aislados más potentes (Fig. 2a) se caracterizaron molecularmente basándose en la huella digital del gen 16SrDNA como Streptomyces mutabilis Nof21 (número de acceso: OP647097), Streptomyces variabilis Am1 (número de acceso: OP647095) y Streptomyces roietensis Bat2 (número de acceso: OP647096).

(a) Actividad quitinolítica de algunos aislados locales pertenecientes a actinomicetos en agar quitina compuesto de quitina coloidal (10,0 g/l), NH4Cl (5 g/l), MgSO4,7H2O (0,5 g/l), KH2PO4 (2,4 g/l ), K2HPO4 (0,6 g/l) y agar bacteriológico (15 g/l). El medio se ajustó a pH 7,0 y la incubación de los cultivos se realizó a 30 °C hasta 6 días. Las zonas claras son indicativas de producción de quitinasa e hidrólisis de quitina. (b) Curso temporal de la producción de enzimas. (c) ensayo de quitinasa en una placa de petri de agar quitina que contiene agar (1,5%, p/v) y quitina coloidal (1%, p/v) a pH 7,0 (b). Se aplicaron cuarenta microlitros de quitinasa a cada pocillo (7 mm de diámetro). Al final del período de incubación, se aplicó una fina capa de solución de yodo de Lugol sobre la superficie de la placa de Petri durante 10 minutos para visualizar la reacción enzimática. Los azúcares simples resultantes de la degradación de la quitina no absorben la solución de yodo, mientras que la quitina no degradada absorbe el tinte y aparece roja.

La enzima se produjo utilizando el medio basal descrito en materiales y métodos a pH 6 y 35 °C durante hasta 6 días. La Figura 2b muestra el impacto del tiempo en la producción de enzimas por Streptomyces variabilis Am1. La producción de enzimas mejoró con el tiempo durante la fase logarítmica del crecimiento bacteriano alcanzando el valor más alto después de 84 h (110,2 U/ml). Mientras que el mejor crecimiento bacteriano se alcanzó al 5° día de incubación (24 mg de peso seco/1 ml de caldo).

Se examinó el impacto de fuentes de carbono como celulosa, lactosa, glucosa, galactosa, fructosa, maltosa, manitol, sacarosa y almidón soluble en una concentración del 2% (p/v). La Figura 3a muestra que la mejor productividad de quitinasa de Streptomyces variabilis Am1 se logró con galactosa, donde la productividad de la enzima fue 3,1 veces mayor que la prueba en blanco. Por otro lado, tanto la sacarosa como el manitol han reprimido la productividad de quitinasa en comparación con el tratamiento control.

Efecto de la fuente de carbono (a) y la fuente de nitrógeno (b) sobre la producción de quitinasa. El medio de fermentación inicial estuvo formado por quitina coloidal (10 g/l), (NH4)2SO4 (5 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l), KH2PO4 (2,4 g/l), K2HPO4 (0,6 g/l). l), NaCl (0,6 g/l), FeSO4.7H2O (0,001 g/l), ZnSO4. 7H2O (0,0001 g/l) y MnSO4. 7H2O (0,0001 g/l). Durante el experimento de la fuente de nitrógeno, se reemplazó (NH4)2SO4 con el material probado. El medio basal se ajustó a pH 6,0 y la fermentación se realizó a 35 °C durante 6 días en modo sumergido con velocidad de agitación de 150 rpm.

La influencia del nitrógeno orgánico como caseína, gelatina, harina de soja, triptona, extracto de levadura y peptona, además de compuestos inorgánicos como acetato de amonio, nitrato de amonio, sulfato de amonio, cloruro de amonio y NaNO3, sobre la secreción de quitinasa, se probó en Concentración del 0,5% (p/v) (Fig. 3b). La productividad máxima de quitinasa se logró con el extracto de levadura con un aumento de 3,3 veces respecto al control. Ninguno de los nitratos de amonio, acetato de amonio y nitrato de sodio pudo mejorar la productividad de quitinasa con la cepa probada (Fig. 3b).

Se realizó la optimización de la productividad enzimática mediante el aislado más potente Streptomyces variabilis Am1 para proceder con la purificación de la enzima. La quitinasa se refinó hasta homogeneidad mediante cromatografía de intercambio aniónico (Fig. 4a) y cromatografía de permeación en gel (Fig. 4b), respectivamente, después de precipitarla con sulfato de amonio al 80%. La recuperación de enzima alcanzó el 23,8% y la actividad específica alcanzó 18,6 veces (Tabla 1). SDS-PAGE presentó una banda con una masa molecular de aproximadamente 56 kDa (Fig. 4c Carril 1). El análisis de zimograma (Fig. 4c, carril 2) del sobrenadante del cultivo también mostró una banda de actividad enzimática.

Cromatograma de la quitinasa producida por Streptomyces variabilis Am1 en una columna de DEAE-celulosa (2 × 30 cm2) (a). Las fracciones activas agrupadas de la columna DEAE-celulosa se purificaron adicionalmente con una columna Sephadex G75 FF (2,0 x 45 cm2) (b). La línea -■- representa la actividad quitinasa, mientras que la línea -○- representa la cantidad de proteína en términos de absorbancia a una longitud de onda de 280 nm. La última proteína recuperada se sometió a SDS-PAGE (c) con gel de apilamiento al 5 % (p/v) y gel de resolución al 15 % (p/v). M representa las proteínas estándar, el carril 1 representa la enzima purificada en gel SDS-PAGE, mientras que el carril 2 representa la actividad de electroforesis en gel (zimograma). El gel nativo contenía 1,0% de quitina coloidal como sustrato, el gel se sumergió en tampón Tris-HCl 0,2 M, pH 8,0 a 40 °C durante 16 h. La actividad quitinasa en el gel nativo se visualizó tiñendo con solución de yodo de Lugol durante 15 minutos y destinción con solución de NaCl 1 N durante 5 minutos a temperatura ambiente. El gel completo se incluye en el archivo de información complementaria (Fig. S1).

El pH óptimo para la quitinasa fue 8,0 y la quitinasa se mantuvo estable a un pH de 4 a 9 durante 60 minutos a 35 °C (Fig. 5a). La mejor temperatura para la quitinasa fue 40 °C (Fig. 5b) y la enzima se mantuvo estable durante 30 minutos a 60 °C (Fig. 5c). Parecía que la quitinasa no se alteraba al preincubar a 50 °C durante 15 minutos. A partir del perfil de inactivación térmica (Fig. 5c), el valor de Tm de quitinasa fue de 66,61 °C usando tampón fosfato 50 mM (pH 8,0) (Fig. 5d).

El efecto del pH sobre la actividad enzimática (-●-) se realizó ajustando las mezclas reaccionantes a diferentes pH (a). Mientras se examinó la estabilidad del pH (-○-) mediante preincubación de la enzima a diferentes pH, luego se determinó la actividad residual contra la quitina coloidal (a). El efecto de la temperatura sobre la actividad quitinasa (b) se estudió mediante incubación de las mezclas reaccionantes a diferentes temperaturas. Mientras que la estabilidad térmica (c) se determinó exponiendo la quitinasa a 50–80 °C durante 15–60 minutos y luego se analizó la actividad residual contra la quitina coloidal. La temperatura media (Tm) a la que la quitinasa probada perdió la mitad de su actividad se calculó a partir de (d).

Los resultados de la Tabla 2 muestran el efecto de iones metálicos como Mg2+, Cu2+, Ca2+, Mn2+, Hg2+, Ag+, Fe2+ y Fe3+ además de β-mercaptoetanol, SDS, EGTA y EDTA sobre la actividad quitinasa a una concentración de 5 mM. En todos los tratamientos se realizó un blanco universal para las comparaciones. La enzima fue ligeramente inhibida por los iones Cu2+ y Mn2+ mientras que fue estimulada por iones Fe2+. Los reactivos proteicos SDS, EDTA y EGTA inhibieron significativamente la quitinasa analizada. Curiosamente, la enzima quelada con EDTA restableció su actividad tras la adición de iones Fe2+ a una concentración de 5 mM.

Después de 7 días de incubación de Eurotium amstelodami, Fusarium oxysporum y Fusarium verticillioides en placas PDA con cada pocillo cargado con 40 µl de la preparación enzimática que contenía 15 U de quitinasa, el potencial antifúngico de las quitinasas analizadas se calculó en milímetros (mm) utilizando un calibre digital y calculando las zonas libres de crecimiento de hongos alrededor del agujero. La mejor actividad antifúngica (Fig. 6) se informó para la quitinasa producida a partir de Streptomyces variabilis Am1, donde ejerció buenos resultados inhibidores contra todos los hongos probados; Eurotium amstelodami (14,28 mm), Fusarium verticillioides (22,40 mm) y Fusarium oxysporum (16,18 mm). Las quitinasas de Streptomyces mutabilis Nof21 y Streptomyces roietensis Bat2 solo inhibieron el hongo fitopatógeno Fusarium verticillioides (14,20 y 14,98 mm, respectivamente). La quitinasa inactivada por calor no mostró actividad contra ninguno de los hongos fitopatógenos probados.

La actividad antifúngica de tres quitinasas producidas por Streptomyces spp locales (Am1, Bat2 y Nof21) contra Eurotium amstelodami (a), Fusarium verticillioides (b) y Fusarium oxysporum (c). Se aplicaron exactamente 40 µl (15 U) de preparaciones enzimáticas a cada pocillo. Se utilizó una preparación de enzima inactiva por calor como control negativo. Se observó crecimiento fúngico periódicamente hasta los 7 días de incubación a 30 °C.

Las quitinasas son muy útiles en la degradación de desechos de quitina y en el control biológico de patógenos que contienen quitina, como hongos, insectos y nematodos. Por lo tanto, se realizó una detección de bacterias quitinolíticas en los ambientes terrestres de Arabia Saudita. Obtuvimos más de cuarenta y seis aislados prometedores. Los aislados más potentes se caracterizaron basándose en la huella digital del gen 16SrDNA como Streptomyces mutabilis, Streptomyces variabilis y Streptomyces roietensis. Respecto a estudios previos, muy pocos autores discutieron la capacidad de estas especies para producir quitinasas. La capacidad de Streptomyces variabilis para producir quitinasa sólo se detectó en dos cepas; cepa LCP1822 y cepa YH2123. Hasta donde sabemos, nunca se ha informado sobre la producción de quitinasa de Streptomyces mutabilis y Streptomyces roietensis.

En términos de productividad enzimática, se seleccionó Streptomyces variabilis para completar este estudio. La producción de enzimas mejoró con el tiempo durante la fase logarítmica del crecimiento bacteriano alcanzando el valor más alto después de 84 h (110,2 U/ml). Mientras que el mejor crecimiento bacteriano se alcanzó al 5° día de incubación (24 mg de peso seco/1 ml de caldo). La fermentación fue mejor para Streptomyces venezuelae P10 a 30 °C después de 96 h9, mientras que Streptomyces sp. ANU6277 produjo el nivel máximo de quitinasa a 35 °C después de 60 h de fermentación13.

La mejor productividad de Streptomyces variabilis Am1 se logró en presencia de galactosa como fuente de carbono (3,1 veces mayor que la prueba en blanco). Según otros investigadores, en el caso de Streptomyces halstedii la producción de quitinasa fue muy potente en presencia de glucosa10, arabinosa en el caso de Streptomyces viridificans11 y almidón en el caso de Streptomyces sp. ANU627713 y Streptomyces aureofaciens12.

La productividad máxima de quitinasa se logró con el extracto de levadura con un aumento de 3,3 veces respecto al control. Ninguno de los nitratos de amonio, acetato de amonio y nitrato de sodio pudo mejorar la productividad de quitinasa en la cepa probada. El extracto de levadura también fue el suministro óptimo de N para la productividad de quitinasa de Streptomyces sp. ANU627713.

Cuando la quitinasa se refinó hasta homogeneidad mediante cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de permeación en gel, mostró una masa molecular de aproximadamente 56 kDa mediante SDS-PAGE (Fig. 4c, carril 1) y electroforesis en gel zimográfica de actividad (Fig. 4c, carril 2). En general, las quitinasas producidas por microorganismos tienen una masa molecular que oscila entre 20 y 120 kDa. Las quitinasas fúngicas tienen un peso que oscila entre 35 y 45 kDa24, mientras que la mayoría de las quitinasas bacterianas pesan principalmente entre 20 y 60 kDa25. Las quitinasas de Streptomyces pesan 20 kDa para Streptomyces sp. M-20 (Kim et al. 2003)14, 28 kDa, 35 kDa y 45 kDa para Streptomyces sp. NK 1057 (Nawani y Kapadnis 2004)26, 34 kDa para Streptomyces sp. DA11 (Han et al. 2009)15, 43 kDa y 45 kDa para S. albovinaceus S-2227, 45 kDa para Streptomyces sp. ANU627713 y 49 kDa para S. griseus HUT 603728 y 66 kDa para Streptomyces venezuelae P109.

El pH óptimo para la quitinasa fue 8,0 y la quitinasa se mantuvo estable a un pH de 4 a 9 durante 60 minutos a 35 °C (Fig. 5a). La mejor temperatura para la quitinasa fue 40 °C (Fig. 5b) y la enzima se mantuvo estable durante 30 minutos a 60 °C (Fig. 5c). Anteriormente, se encontró que la temperatura de reacción óptima para las quitinasas de Streptomyces específicamente era 40 °C29 y en el rango de 30 a 55 °C en general30. Streptomycessp. La quitinasa M-20 ejerció su actividad máxima a 30 °C y pH 5,0; además, fue estable a pH 4,0–8,0 y térmicamente estable hasta 40 °C14. La quitinasa P10 de Streptomyces venezuelae fue máximamente activa a 35 °C y pH 6–89. Mientras que la quitinasa de Streptomyces sp. DA11 fue máximamente activo a 50 °C y pH 815.

Sugerimos un tipo metaloenzima con iones férricos como cofactores porque la quitinasa quelada con EDTA restableció su actividad tras la adición de iones Fe2+. No sugerimos quitinasa con grupos tiol ya que no hubo aumento en la actividad tras el tratamiento con β-mercaptoetanol e iones Hg2+. Groleau et al.31 también informaron sobre la inhibición de la quitinasa por SDS. Streptomyces sp. también informó sobre la inhibición de la enzima por los agentes quelantes EGTA y EDTA. quitinasa DA1115 y fue diferente con Streptomyces sp. quitinasa M-2014 y Streptomyces sp. Quitinasa S-8416.

La quitinasa Am1 de Streptomyces variabilis ejerció buenos resultados inhibidores contra todos los hongos probados; Eurotium amstelodami, Fusarium verticillioides y Fusarium oxysporum. La dependencia de la actividad hidrolítica de las enzimas quitinolíticas microbianas en el control biológico de hongos dañinos, especialmente los de tipo fitopatógeno, está bien establecida en muchos estudios. Se descubrió que las enzimas quitinolíticas de actinobacterias, especialmente del género Streptomyces, tienen diversos mecanismos de actividad antifúngica, como la inhibición de la germinación de las esporas de hongos, la inhibición del alargamiento del tubo germinal y la inducción de la rotura de las esporas y las puntas de las hifas12,32. La aplicación de quitinasas bacterianas en aplicaciones antifúngicas se informó por primera vez en Streptomyces griseus HUT 603733. Se descubrió que la quitinasa P10 de Streptomyces venezuelae inhibía Aspergillus niger al máximo, pero no inhibía a Penicillium chrysogenum9. Streptomycessp. Se empleó quitinasa DA11 para el biocontrol de Aspergillus niger (11,0 mm) y Candida albicans (10,5 mm)15. Hoster et al.29 encontraron actividad quitinasa de una cepa de Streptomyces contra Fusarium culmorum, Aspergillus nidulans, Gulgnardia bidwellii, Botrytis cinerea y Sclerotia sclerotiorum. Narayana y Vijayalakshmi13 informaron sobre la actividad quitinolítica de Streptomyces sp. ANU6277 contra Fusarium udum. Kim et al.14 revelaron la inhibición del fitopatógeno Botrytis cinerea por la quitinasa de Streptomyces sp. M-20.

La capacidad de las especies probadas de Streptomyces para producir quitosano y NC de quitosano a partir de la degradación de quitina (Fig. 1a-e) puede ser herramientas adicionales en su actividad antifúngica además de la actividad de hidrólisis de la quitinasa. Respecto a otros investigadores, muchos investigadores utilizaron el quitosano como agente antibacteriano y antifúngico debido a su naturaleza policatiónica que facilita la adsorción a los componentes celulares cargados negativamente en la superficie de los microorganismos patógenos34.

Una mayor degradación del quitosano en nanopartículas (NP) y NC de quitosano mejora su potencial antifúngico debido a la mejora del área de superficie y la capacidad de encapsulación35. Además, la exposición de microbios, incluidos hongos, a nanopartículas metálicas crea estrés oxidativo en forma de especies reactivas de oxígeno que alteran la permeabilidad selectiva de las células e inhiben los ácidos nucleicos y la síntesis de proteínas.

Las NP y NC de quitosano se prepararon mediante métodos químicos y físicos y los investigadores agrícolas las utilizaron como antifúngicos para sustituir el uso de fungicidas químicos. Por ejemplo, Chouhan et al.36 han controlado la pudrición del trigo por Fusarium mediante NP de quitosano preparadas químicamente. Las NP y NC preparadas biológicamente son ecológicas, biocompatibles, tienen una permeabilidad superior en la célula, menor toxicidad y menor costo37. Respecto a otros investigadores, se utilizó un conjugado de NP de quitosano y NP de plata como compuesto antifúngico contra especies de Fusarium. Desafortunadamente, era costoso y resultó inadecuado para su aplicación en el campo en agricultura38. El valor de esta investigación es que es la primera vez que se producen NP y NC de quitosano utilizando Streptomyces. En particular, los nanocristales tienen una actividad superior a otras formas de nanopartículas.

Como conclusión, se recuperaron cuarenta y seis aislados quitinolíticos de la rizosfera de algunas plantas del desierto en Arabia Saudita. Los tres primeros se recuperaron de la región de las raíces de plantas silvestres que crecían en el desierto de Great Nafud, el desierto de Dahna y el desierto de North Shaqra y luego se identificaron como Streptomyces mutabilis Nof21, Streptomyces variabilis Am1 y Streptomyces roietensis Bat2, respectivamente. Según nuestro conocimiento, nunca se ha informado sobre la producción de quitinasas de Streptomyces mutabilis y Streptomyces roietensis, además, nunca se ha realizado la caracterización de quitinasas de Streptomyces variabilis. Curiosamente, SEM reveló la formación de NC de quitosano junto con el quitosano a partir de la degradación de la quitina. La capacidad de las especies probadas de Streptomyces para producir quitosano y NC de quitosano a partir de la degradación de quitina pueden ser herramientas adicionales en su actividad antifúngica además de la actividad de hidrólisis de la quitinasa. El quitosano en sí es un agente antimicrobiano debido a su capacidad para adsorber las células de microorganismos patógenos. Las NC de quitosano mejoran el potencial antifúngico debido a la mejora de la superficie y la creación de estrés oxidativo. El valor de esta investigación es que es la primera vez que se producen NC de quitosano utilizando Streptomyces. Además, la capacidad única de esta metalo-quitinasa en la degradación de la quitina, la estabilidad del pH y la resistencia térmica que muchas enzimas quitinolíticas, podría considerarse un agente quitinolítico más eficaz dirigido a hongos fitopatógenos en particular.

Sephadex G75 FF (flujo rápido) y DEAE-celulosa se obtuvieron de Pharmacia Biotech (Suecia). La quitina, el β-mercaptoetanol, el SDS, el EGTA y el EDTA se obtuvieron de Sigma-Aldrich (EE. UU.). Los reactivos adicionales eran de grado analítico y se compraron a proveedores regionales.

Se recolectaron desechos de caparazones de camarón en el mercado pesquero regional de Dammam, en Arabia Saudita. Para eliminar la humedad, se secaron al sol hasta obtener un peso seco constante. Luego se molieron hasta obtener un polvo fino. La quitina se extrajo del polvo de camarón entero mediante el paso de desmineralización y el paso de desproteinización39. Luego se preparó quitina coloidal mediante la adición de 5 g del material anterior a 88 ml de HCl concentrado y se dejó agitar en un agitador magnético durante 3 h. Se añadió exactamente un litro de agua destilada fría y se agitó durante otras 3 h. La suspensión se dejó en refrigeración a 4°C durante 24 h. El sedimento blanco denso se recogió mediante filtración Buchner. La pasta es quitina coloidal que se suspendió en agua destilada y se repite la filtración para eliminar el HCl y los residuos solubles no deseados. La última pasta se mantiene a 4 °C para los siguientes usos.

Se obtuvieron varias muestras de suelo de diferentes localidades de Arabia Saudita. Inicialmente, se mezclaron 1000 µl de diluciones apropiadas con placas de agar quitina que consistían en quitina coloidal (10,0 g/l), NH4Cl (5 g/l), KH2PO4 (2,4 g/l), MgSO4,7H2O (0,5 g/l), K2HPO4 (0,6 g/l) y agar bacteriológico (15 g/l). El medio se corrigió a pH 7,0 y la incubación se realizó a 35 °C durante hasta 6 días. Los anillos despejados alrededor de las colonias se tomaron como el primer indicio de hidrólisis de quitina. Los aislados quitinolíticos se purificaron mediante estrías cuadradas y las colonias unicelulares se conservaron a -80 °C en 20% (v/v) de glicerol esterilizado.

El medio de fermentación inicial utilizado para la evaluación de la productividad de quitinasa entre los aislados recuperados de muestras de suelo consistió en quitina coloidal (10,0 g/l), (NH4)2SO4 (5,0 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l), KH2PO4 (2,4 g/l), K2HPO4 (0,6 g/l), NaCl (0,6 g/l), FeSO4.7H2O (10,0 mg/l), ZnSO4. 7H2O (1,0 mg/l) y MnSO4. 7H2O (1 mg/l). El medio basal se corrigió a pH 6,0 y luego se esterilizó en autoclave durante 15 minutos a 121 °C. Después de enfriarse por debajo de 45 °C, cada matraz Erlenmeyer de 250 ml contenía 50 ml de líquido y se inoculó con 2 ml (107 esporas/ml) de un cultivo de 7 días. La incubación se realizó a 35 °C durante 6 días en una incubadora con agitación a una velocidad de 150 rpm. El crecimiento microbiano se eliminó mediante filtración y luego centrifugación a 5000 rpm durante 20 min. Se evaluó la producción de enzimas entre los aislados y se seleccionó el aislado más potente. Luego se optimizaron los parámetros nutricionales y ambientales para lograr el nivel más alto de productividad de quitinasa. El caldo de fermentación final se utilizó para la purificación de enzimas.

Se empleó el QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Alemania) para la extracción de ADN bacteriano siguiendo las pautas del proveedor. El gen que codifica el ARNr 16S se amplificó parcialmente empleando 10 µM de cada cebador universal: 27F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3') como cebador directo y 800R (5'TACCAGGGTATCTAATCC3') como cebador inverso. Luego se inició la PCR a 95 °C durante 10 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a la misma temperatura durante 1 min, el paso de hibridación a 56 °C durante 1,15 min y el paso de extensión durante 2 min a 72 °C, seguido por paso de extensión final a 72 °C durante 5 min. El producto de reacción se eluyó en electroforesis en gel de agarosa de agarosa al 1,5%. El gel se tiñó con una solución de bromuro de etidio y luego se visualizaron las bandas del gel bajo luz UV. Los amplicones de PCR se purificaron mediante ExoSAP-IT (Applied Biosystems, EE. UU.) y los amplicones purificados se prepararon para la secuenciación mediante el kit de secuenciación de ciclo Big Dye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems, EE. UU.) y el kit de purificación DyeEx (Qiagen, Alemania). La secuenciación se realizó en un analizador genético SeqStudio (Applied Biosystems, EE. UU.). En consecuencia, las secuencias parciales del gen 16S rRNA adquiridas se depositaron en la base de datos GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) después de identificar las especies con mayor similitud utilizando el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) mediante búsquedas BLAST (http: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

La reacción enzima-sustrato se inició mezclando 1 ml de suspensión de quitina coloidal al 10% (p/v) en tampón fosfato de sodio 0,2 M (pH 7,0) con 1 ml de preparación enzimática. La reacción se desarrolló a 50 °C y luego se terminó después de 1 h con 1 ml de NaOH al 1 % y se incubó en un baño de agua hirviendo (100 °C) durante 5 min. La centrifugación se realizó a 5000 rpm durante 15 minutos para separar el producto del sustrato que no reaccionaba. Luego, los azúcares reductores totales se midieron mediante el ensayo de ácido dinitrosalicílico (DNS)40. Exactamente, se combinó 1 ml del sobrenadante con 1 ml de DNS al 1% en tartrato de sodio y potasio al 30% en NaOH 2 M. La mezcla se agitó y se reincubó en un baño de agua hirviendo durante 10 min. El cambio de color hacia el rojo es una indicación directa de la presencia de azúcares reductores y por tanto proporcional a la actividad enzimática. La absorción de la muestra de prueba se midió en A535 (espectrofotómetros UV/VIS UV5 Excellence, Mettler Toledo, Suiza). Se calculó una unidad (U) de quitinasa como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 µmol de NAG como azúcar reductor por minuto a 50 °C. La cuantificación de proteínas se realizó en A280 utilizando albúmina sérica bovina (BSA) como proteína estándar.

En algunos experimentos, la actividad quitinolítica se visualizó mediante placas de difusión de pozos de agar quitina que consistían en quitina coloidal (10 g/l) y agar (15 g/l) a pH 7,0. Exactamente, se agruparon pocillos de 10 mm de diámetro utilizando un porador de corcho estéril. Se añadieron cincuenta µl de preparación enzimática a cada pocillo. El blanco se realizó con 50 µl de una preparación de quitinasa térmicamente inactivada. La formación de halos aclarados se comprobó después de 24 h a 35 °C mediante la adición de una fina capa de solución de yodo de Lugol sobre la superficie de la placa de Petri durante 10 min. Los azúcares simples resultantes de la degradación de la quitina no absorben la solución de yodo, mientras que la quitina no degradada absorbe el tinte y aparece roja.

El procedimiento de separación de quitinasa del caldo de cultivo del aislado más potente se inició mediante centrifugación a 5000 rpm durante 15 minutos para separar las células y los desechos de los productos bacterianos. Luego se precipitaron las proteínas y enzimas presentes en el sobrenadante mediante la adición de sulfato de amonio gradualmente con agitación frecuente hasta alcanzar el nivel de saturación del 80%. Después de 12 h de incubación a 4 °C, las moléculas de enzima aglomeradas se recogieron mediante centrifugación a 7000 g durante 10 min a 4 °C. Luego, la recolección se suspendió en tampón Tris-HCl 100 mM de pH 7,4 (tampón A) para diálisis contra tampón A para eliminar el sulfato de amonio y otras sales. Luego, el dializado resultante se aplicó sobre la parte superior de una columna de cromatografía con intercambiador aniónico de DEAE-celulosa de 2,0 x 30 cm2 de dimensión. La elución se realizó con tampón de borato 100 mM, pH 9,4 (tampón B) con NaCl 0–1 M en forma de gradiente lineal. Las fracciones activas de la columna de intercambio aniónico se ensamblaron y liofilizaron para su posterior purificación con la técnica de cromatografía de permeación en gel. Para ello se utilizó una columna Sephadex G75 FF de dimensión 2,0 × 45 cm2. La elución a través de esta columna se realizó con tampón A a un caudal de 0,5 ml por minuto. Nuevamente, las fracciones que representan la actividad quitinasa se combinaron y liofilizaron para su caracterización y aplicación. Finalmente, se realizó SDS-PAGE usando gel de apilamiento al 5 % (p/v) y gel de separación al 12 % (p/v) para comprobar la pureza de la quitinasa y verificar la masa molecular exacta de la quitinasa analizada. Para el análisis de zimograma, la quitinasa cruda se mezcló con el tampón de carga sin agente reductor ni paso de ebullición. Después de la electroforesis, en un gel que contenía 1,0% de quitina coloidal como sustrato, el gel se sumergió en tampón Tris-HCl 0,2 M, pH 8,0 a 40 °C durante 16 h. La actividad quitinasa en el gel nativo se visualizó tiñendo con solución de yodo de Lugol durante 15 minutos y destinción con solución de NaCl 1 N durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Las mezclas de reacción quitinasa-sustrato se corrigieron a varios pH. El rango de pH de 2,0 a 6,0 se logró con el tampón citrato-fosfato, el rango de pH de 7,0 a 8,0 se logró con el tampón Tris-HCl y los pH de 9,0 a 11,0 se lograron con el tampón glicina-NaOH. El ensayo de actividad quitinasa se realizó a 35 °C utilizando el sustrato quitina coloidal. Además, la estabilidad del pH se evaluó mediante la preincubación de quitinasa sola durante 60 minutos a 35 °C en el mismo rango de pH, luego se evaluó la actividad restante contra la quitina coloidal a pH 8,0 con tampón Tris-HCl 50 mM.

El impacto de la temperatura sobre la enzima se evaluó entre 20 °C y 50 °C. El sustrato quitina coloidal se utilizó a una concentración del 1,5% (p/v). La quitina coloidal se ajustó a pH 8,0 en tampón Tris-HCl 50 mM. La estabilidad al calor de la quitinasa se evaluó mediante la preincubación de preparaciones de quitinasa sin sustrato en el mismo tampón a altas temperaturas de 50 a 80 °C durante 15 a 60 minutos. A intervalos de tiempo se evaluó la actividad restante. La temperatura a la que la quitinasa perdió la mitad de su actividad original después de 60 minutos de exposición se definió como la temperatura del punto medio (Tm).

La quitinasa purificada se preincubó a 35 °C durante 60 min en presencia de un metal como Mg2+, Cu2+, Ca2+, Mn2+, Hg2+, Ag+, Fe2+ y Fe3+ además de reactivos comunes como β-mercaptoetanol, SDS, EGTA. y EDTA. Se probaron con una concentración de 5 mM en tampón fosfato 50 mM (pH 8,0). Luego se evaluó la actividad restante. La actividad de la quitinasa en ausencia de metales, activadores o inhibidores se consideró del 100%.

El potencial antifúngico de las tres quitinasas purificadas Am1, Bat2 y Nof21 se estudió mediante el método de difusión en pozos de agar según el Comité Nacional de Estándares de Laboratorio Clínico (NCCLS)41. Se distribuyeron uniformemente suspensiones de esporas de cinco días (3 × 107/ml) a una concentración de 1 ml de Eurotium amstelodami (Aspergillus amstelodami), Fusarium oxysporum y Fusarium verticillioides de forma individual en placas de agar patata dextrosa con pH ajustado a 5,5. Los cultivos se dejaron a temperatura ambiente durante 10 min para permitir la absorción del inóculo. Se perforaron pocillos de ocho mm utilizando un perforador de corcho estéril y se aplicaron cuarenta µl de preparación de quitinasa a cada pocillo (15 U). Se utilizó una preparación de enzima inactiva por calor como prueba negativa. El crecimiento de los hongos se observó periódicamente a 30 °C durante 7 días. Las pruebas se realizaron en tres réplicas para garantizar la confiabilidad.

Las pruebas se realizaron por triplicado y los resultados se dieron como medias ± desviaciones estándar.

Todos los datos generados y analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado. Los conjuntos de datos generados durante el estudio actual están disponibles en la base de datos GenBank con el número de acceso OP647097 para Streptomyces mutabilis Nof21, el número de acceso OP647095 para Streptomyces variabilis Am1 y el número de acceso OP647096 para Streptomyces roietensis Bat2.

Comité Nacional de Normas de Laboratorio Clínico

Dietilaminoetilcelulosa

Ácido dinitrosalicílico

Ácido etilendiaminotetraacético

Ácido etilenglicol-bis(β-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-tetraacético

N-acetil-D-glucosamina

Agar patata dextrosa

Dodecil sulfato de sodio

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

Valor de temperatura del punto medio

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Los autores desean agradecer al profesor Medhat A. ElNaggar del Centro de Investigación Agrícola, Instituto de Investigación de Patología Vegetal, Egipto, y el Laboratorio Central de Investigación, SAGO, Arabia Saudita, por proporcionarnos los hongos fitopatógenos.

Los autores expresan su agradecimiento a la Diputación de Investigación e Innovación del Ministerio de Educación de Arabia Saudita por financiar este trabajo de investigación a través del proyecto número IF-2020-028-BASRC en la Universidad Imam Abdulrahman bin Faisal (IAU)/Centro de Investigación Científica Básica y Aplicada ( BASRC).

Centro de Investigación Científica Básica y Aplicada (BASRC), Universidad Imam Abdulrahman Bin Faisal (IAU), PO Box 1982, Dammam, 31441, Arabia Saudita

Essam Kotb, Amira H. Alabdalall, Azzah I. Alghamdi, Ibtisam M. Ababutain, Safa K. Al-Zuwaid, Batool M. Algarudi y Sakina M. Algarudi

Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Imam Abdulrahman Bin Faisal (IAU), PO Box 1982, Dammam, 31441, Arabia Saudita

Essam Kotb, Amira H. Alabdalall, Azzah I. Alghamdi, Ibtisam M. Ababutain, Safa K. Al-Zuwaid, Batool M. Algarudi y Sakina M. Algarudi

Centro Nacional de Tecnología Genómica (NCGT), Instituto de Investigación sobre Ciencias de la Vida y Medio Ambiente, Ciudad Rey Abdulaziz para la Ciencia y la Tecnología (KACST), Riad, Arabia Saudita

Sumayh A. Aldakeel

Laboratorio de Genómica de Enfermedades Infecciosas, Centro Saudita para la Prevención y el Control de Enfermedades, Autoridad de Salud Pública, Riad, Arabia Saudita

Sumayh A. Aldakeel

Departamento de Estadística, Facultad de Comercio, Universidad Al-Azhar (rama femenina), PO Box 11751, El Cairo, Egipto

Asmaa Ahmed

Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad Rey Saud, Riad, Arabia Saudita

Ahmed M. Albarrag

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

EK y AHA realizaron ensayos y caracterización enzimática. AIA e IMA evaluaron la actividad antifúngica de las quitinasas recuperadas y el estudio SEM. SAA y AMA han realizado la caracterización molecular de los aislados. SKA, SMA y BMA recolectaron muestras de suelo, aislaron los microorganismos y realizaron la detección inicial de la actividad quitinasa. AAA realizó las estadísticas, gráficos y presentación de datos. Todos los autores contribuyeron por igual a escribir, editar y redactar el manuscrito y aprobaron el formato final.

Correspondencia a Essam Kotb.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Kotb, E., Alabdalall, AH, Alghamdi, AI et al. Detección de bacterias que degradan la quitina en el ambiente de Arabia Saudita y caracterización de la quitinasa más potente de Streptomyces variabilis Am1. Informe científico 13, 11723 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38876-2

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Recibido: 12 de febrero de 2023

Aceptado: 16 de julio de 2023

Publicado: 20 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38876-2

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Detección de bacterias que degradan la quitina en el medio ambiente de Arabia Saudita y caracterización de la quitinasa más potente de Streptomyces variabilis Am1