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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11399 (2023) Citar este artículo

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Se obtuvieron cuatro aislados bacterianos de sedimentos marinos recolectados de Sahl Hashish, Mar Rojo de Hurghada, Egipto. Este estudio fue diseñado para buscar polisacáridos naturales prometedores contra el Alzheimer; por lo tanto, se analizaron cuatro aislados para determinar la producción de exopolisacáridos (EPS) y la inhibición de la acetilcolinesterasa. El aislado S16 proporcionó el mayor rendimiento de EPS (7,51 g/l) e inhibición de la acetilcolinesterasa. Se identificó morfológica y genéticamente mediante análisis de secuencia del gen 16S rRNA como Bacillus maritimus. Se estimó un análisis fisicoquímico del exopolisacárido S16 (BMEPS), que apuntó a la presencia de ácido urónico y sulfato (24,7% y 18,3%, respectivamente). El análisis por HPLC indicó que el ácido manurónico, el ácido glucurónico, la glucosa y la manosa se presentan en una relación molar de 0,8:1,0:2,8:2,3, respectivamente. Además, FT-IR reveló una gran cantidad de configuraciones β. El GPC estimó el peso molecular promedio (Mw) en 4,31 × 104 g/mol. BMEPS inhibió AChE (IC50; 691,77 ± 8,65 μg/ ml), BChE (IC50; 288,27 ± 10,50 μg/ ml) y tirosinasa (IC50; 3,34 ± 0,09, 14,00 ± 0,14 y 22,96 ± 1,23 μg/ ml durante las duraciones de incubación de 10, 20 y 40 minutos). También demostró una acción antiinflamatoria selectiva contra la COX-2 en lugar de la COX-1. Además, BMEPS exhibió capacidades antioxidantes como eliminador de radicales libres y especies reactivas de oxígeno (ROS), quelante de metales, agente reductor y supresor de la peroxidación lipídica. Estas actividades se deben a la distinta composición química. Los hallazgos de este estudio indican que BMEPS podría considerarse como un material prometedor contra la enfermedad de Alzheimer (EA) en un modelo in vitro, lo que lo califica para estudios avanzados in vivo en el descubrimiento de tratamientos alternativos para el Alzheimer.

La sustancia orgánica más frecuente en el mundo es el polisacárido1. Los polisacáridos son macromoléculas biológicas comunes que participan en una amplia gama de funciones fisiológicas en los seres humanos. Realiza una amplia gama de funciones biológicas, incluido el control de la función inmunológica, la presión arterial, el azúcar en sangre y la circulación sanguínea1. Los polisacáridos industriales suelen derivarse de plantas, animales, algas y microbios. Los microorganismos secretan polímeros solubles o insolubles llamados EPS2. Además, los microorganismos se consideran estructuras altamente reproducibles entre todos los proveedores de polisacáridos y están estrechamente regulados, mientras que las estructuras de exopolisacáridos (EPS) producidas a partir de fuentes vegetales y animales están influenciadas por las circunstancias climáticas, ambientales y alimentarias. Principalmente, los ambientes marinos constituyen un entorno considerable y distintivo donde se requieren diversas poblaciones bacterianas para funciones esenciales para la supervivencia de la ecología del planeta. Por otro lado, los EPS se utilizan frecuentemente como agentes viscosificantes, estabilizantes, gelificantes o emulsionantes en la industria alimentaria debido a sus cualidades físicas y reológicas distintivas2. Los polisacáridos microbianos se incorporan a nuevos objetivos, como biofloculantes, bioabsorbentes, agentes de eliminación de metales pesados ​​y de administración de fármacos3. Además, entre los efectos biológicos de los EPS4 se encuentran acciones antitumorales, antivirales, inmunoestimulantes y antiinflamatorias. Entre los microorganismos, la savia de Bacillus. Las cepas producen muchos tipos de EPS, como levano, β-(1,3)-glucan5, EPS ácidos de B. amyloliquefaciens 3MS 20176 marino y EPS ácidos de Bacillus sp. NRC57. Algunos EPS de Bacillus demostraron propiedades emulsionantes, floculantes, de eliminación de metales pesados ​​o medicinales excepcionales5.

La EA es un trastorno crónico relacionado con la neurodegeneración8. Actualmente, alrededor de ≃ 50 millones de personas son diagnosticadas con EA y se prevé que para 2050 esta cifra supere los 130 millones9. Las anomalías asociadas con varias operaciones fisiológicas importantes son las culpables de la toxicidad multidimensional, que también incluye toxicidad colinérgica, carga de amiloide, toxicidad de iones metálicos, toxicidad de tau, daño biomolecular, estrés oxidativo, indignación inmune, toxicidad neurovascular, dishomeostasis de iones de calcio, disfunción linfática. , disfunciones mitocondriales, toxicidad mediada por α-sinucleína, disfunciones sinápticas, toxicidad de membrana, disfunciones de la apoptosis, deterioro de la actividad de la telomerasa, modificaciones postraduccionales aberrantes, desequilibrio e infección microbiana, hiperglucemia, estrés del retículo endoplásmico, hipercolesterolemia, disfunciones de la autofagia, riesgo genético y resistencia a la insulina y diabetes10. En el SNC (sistema nervioso central), en condiciones normales, los iones metálicos (CuII, ZnII y FeIII) desempeñan el papel de cofactores de enzimas y desempeñan funciones mitocondriales y neuronales11. Por el contrario, ZnII, CuII y FeII se coordinan con Aβ y aceleran la acumulación de amiloide y la formación de placas dependientes de metales. Los complejos Aβ-Cu y Aβ-Fe inducen la producción de un exceso de especies intermedias reactivas (RIS). Los RIS son componentes cruciales para inducir estrés oxidativo y neuroinflamación8. Por tanto, el descubrimiento de materiales quelantes de metales es un enfoque terapéutico prometedor. La sobreproducción de RIS (radical superóxido, peróxido de hidrógeno, radical hidroxilo, óxido nítrico, peroxinitrito y ácido hipocloroso) fomenta un estrés oxidativo crítico que daña los lípidos y las proteínas y provoca la muerte neuronal. Los tejidos cerebrales de la EA sufren considerablemente debido a niveles excesivos de RIS8. Los iones metálicos activos redox (CuII y FeIII) capturan el péptido Aβ, estabilizan las especies oligoméricas y funcionan como depósito para producir un exceso de RIS12. Por lo tanto, el estrés oxidativo es la base del avance de la EA y un objetivo potencial en los tratamientos de la EA10. La membrana plasmática neuronal contiene una gran cantidad de ácidos grasos poliinsaturados que son susceptibles a la peroxidación por RIS, lo que induce componentes neurotóxicos como el 4-hidroxinonenal13. En el tejido cerebral de la EA, los microdominios de colesterol mediados por el estrés oxidativo inhiben la vitamina E antioxidante en la membrana lipídica. Según la explicación anterior, el estrés oxidativo es el paso clave en las disfunciones celulares relacionadas con la EA. Paralelamente, se ha demostrado que muchos polisacáridos obtenidos de organismos tienen capacidades antioxidantes, incluida i) captura de iones metálicos (CuII, ZnII y FeIII); ii) inhibición de la producción de ROS y RNS; iii) protección de los lípidos frente a la peroxidación; y iv) neutralización de radicales libres. Por ejemplo, EPS de Adansonia digitata14, EPS de Novel Bacillus sp. M315, EPS de paenibacillus lactes NRC116, EPS de B. amyloliquefaciens 3MS 20176 y EPS de Bacillus sp. NRC57. Por otro lado, las neuronas colinérgicas desempeñan un papel crucial en una variedad de procesos cognitivos, incluida la memoria, la atención, la respuesta y el procesamiento de la información sensorial. El deterioro de las neuronas colinérgicas se asocia con toxicidad colinérgica. Por tanto, la mejora de la neurotransmisión colinérgica sigue siendo el enfoque principal en el tratamiento sintomático de los trastornos cognitivos y del comportamiento en las primeras etapas de la EA10. Cuando la acetilcolinesterasa (AChE) está presente en la hendidura sináptica, la acetilcolina se hidroliza en colina y ácido acético. La colina acetiltransferasa (ChAT) y las enzimas AChE controlan la síntesis y degradación de ACh10. El defecto en la actividad de ChAT o la hiperactividad de la AChE en pacientes con EA provoca una reducción considerada del contenido de ACh en la hendidura sináptica de la corteza, el hipocampo y la amígdala. Por tanto, la reparación de malformaciones neuronales colinérgicas es un objetivo para mejorar los trastornos cognitivos en pacientes con EA. En consecuencia, los inhibidores de la AChE previenen la hidrólisis de la ACh cerebral, lo que aumenta las concentraciones de ACh cerebral y mejora la deficiencia de la neurotransmisión colinérgica cerebral. Muchos polisacáridos de organismos tienen un efecto inhibidor de la AChE, como los EPS de Achromobacter piechaudii NRC217, los EPS de Isochrysis galbana y Nannochloropsis oculate18, y los polisacáridos de hongos19.

Por otro lado, la catálisis de tirosinasa es la conversión del aminoácido L-tirosina en el compuesto L-3,4-dihidroxifenilamina (L-DOPA). Los neurotransmisores cruciales norepinefrina y epinefrina son precursores de los neurotransmisores clave L-DOPA y dopamina, respectivamente. La tirosinasa es activada por las proteínas 14-3-3 mediante unión dependiente de fosforilación. La tirosinasa y los trastornos neurodegenerativos como el Alzheimer, el Parkinson y la enfermedad de Huntington están indirectamente relacionados debido a las proteínas 14-3-3. Además, la tirosinasa puede dañar las neuronas al producir dopamina quinonas, que pueden oxidar el anillo catecol de la dopamina para producir el compuesto extremadamente reactivo dopamina quinona. La oxidación de la dopamina inhibe la locomoción de dopamina, la locomoción de glutamato y la respiración mitocondrial20. Los inhibidores de la tirosinasa son medicamentos que pueden suprimir la actividad de la tirosinasa. Varios polisacáridos de origen natural mostraron actividad antitirosinasa, como los polisacáridos del pericarpio del fruto, polisacáridos longan21, Usnea longissima22.

El estudio actual fue diseñado para buscar un nuevo exopolisacárido bioactivo (EPS) de fuentes marinas acompañado de su aislamiento, identificación y caracterización, seguido de un examen de ruta in vitro de este polisacárido en el tratamiento de los factores de riesgo de Alzheimer: estrés oxidativo, progresión de la inflamación, degradación de neurotransmisores y acumulación de β-amiloide.

Se evaluaron cuatro aislados de bacterias marinas, S4, S7, S13 y S16, y se encontró que tenían un rendimiento relativamente alto de EPS de 6,99, 8,66, 7,22 y 7,51 g/l, respectivamente (Tabla 1). Se ha investigado la actividad acetilcolinesterasa de los EPS de cuatro aislamientos. En una prueba de detección primaria, los EPS (S4 y S16) demostraron ser los aislados con mayor nivel de inhibidores de la acetilcolinesterasa (42,0 y 52,2 %, respectivamente) en una concentración de 1000 µg/mL (Tabla 1). Se ha investigado la actividad acetilcolinesterasa de los EPS de cuatro aislamientos. En una prueba de detección primaria, los EPS (S4 y S16) demostraron ser el aislado más alto como inhibidor de la acetilcolinesterasa (42,0 y 52,2%, respectivamente) en una concentración de 1000 µg/mL (Tabla 1).

La mayoría de los aislados bacterianos que tienen una alta actividad de inhibición de la acetilcolinesterasa (S16) se sometieron a características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas. La colonia y las características morfológicas del S16 aislado, tres días de incubación a 37 °C siguieron al esparcimiento de los cultivos puros en placas. Además, la cepa formó colonias mucoides, viscosas y brillantes en placas de agar y fue capaz de producir hebras largas cuando se expandió usando un asa de inoculación, exhibiendo las propiedades típicas de los fenotipos productores de EPS. S16 se identificó en base a características morfológicas y culturales, así como a estudios fisiológicos y bioquímicos. Basado en las secuencias de ARNr S16 de la cepa S16, se creó un árbol filogenético. El aislado bacteriano (S16) se identificó principalmente como grampositivo, formador de endosporas, textura suave, forma de varilla (Fig. 1A), catalasa positivo, hidrólisis de almidón positivo y prueba de Voges-Proskauer (VP), prueba de citrato negativa. El análisis filogenético del ARNr 16S demostró que el aislado bacteriano prometedor (S16) pertenecía a la subdivisión gamma del filo Proteobacteria y está estrechamente relacionado con Bacillus maritimus MSM1 con número de acceso MK829155 (Fig. 1B).

Morfología de la colonia de Bacillus maritimus MSM1 en medio marino sólido (A) y árbol filogenético de cepa de unión vecina basado en secuencias del gen 16S rRNA (B).

El alto nivel de EPS fue de 7,51 g/L cuando se fermentó a 37 °C durante 3 días, según lo determinado por el ensayo de fenol-H2SO4 utilizando glucosa como estándar. El EPS bruto se obtuvo a partir del caldo fermentado mediante precipitación con etanol y deshidratación con acetona y éter dietílico. Después de la centrifugación y la decantación de etanol antes mencionada, el EPS bruto se sometió a otra etapa de precipitación con etanol al 100% frío. Luego, el sedimento resultante se calentó suavemente en un baño de agua a 50 °C nuevamente para lograr la disolución completa. Luego se volvió a disolver el sedimento en una cantidad mínima de agua desionizada. Después de eso, el pellet se redisolvió en una pequeña cantidad de agua desionizada, y para la disolución completa del pellet, se requirió nuevamente un calentamiento suave en un baño de agua a 50 °C. La solución dializada se precipitó fraccionadamente con 1, 2 y 3 litros de etanol absoluto frío después de ajustar el pH de la solución transparente y dializarla tres veces. La fracción mayoritaria obtenida por 1 volumen de etanol absoluto se secó al vacío a 40 ºC para obtener BMEPS, que se aplicó al siguiente análisis. Mostró solo un pico a 210 nm en el espectro UV de BMEPS, y no hubo picos entre 260 y 290 nm, lo que demostró que no se observaron proteínas ni ácidos nucleicos en BMEPS. Según un estudio de espectroscopía UV-Vis, la mayor absorción se produjo entre 200 y 220 nm debido a las transiciones n- y/o-*, que son típicas de los grupos funcionales amina. Además, según el análisis colorimétrico de m-hidroxidifenilo, BMEPS incluía 18,3% de sulfato y 24,7% de ácido urónico. El espectro FT-IR (Fig. 2A) mostró una banda poderosa a 3412,52 cm-1, atribuida a la vibración de estiramiento BMEPS O-H. La banda de 2927,24 cm-1 fue causada por una vibración de estiramiento C-H. Un pico prolongado simétrico cerca de 1386,72 cm-1 mostró la existencia de grupos COO-. La absorción prominente a 1641,52 cm-1 se atribuyó a vibraciones C = O. Además, las absorciones distintivas a 915,22 cm −1 sugieren la presencia simultánea de configuraciones β en BMEPS. Se realizó el análisis por HPLC de la estructura química de BMEPS y la comparación con estándares de monosacáridos. BMEPS estaba compuesto de ácido manurónico, ácido glucurónico, glucosa y manosa en una proporción molar de 0,8:1,0:2,8:2,3, respectivamente (Fig. S1, datos complementarios). El análisis GPC (Fig. 2B) estimó que el peso molecular promedio (Mw) del BMEPS era 4,31 × 104 g/mol y el número molecular promedio (Mn) 3,87 × 104 g/mol. La disparidad, que se define como la relación entre Mw y Mn, fue igual a 1,1.

El espectro FTIR de BMEPS de Bacillus maritimus MSM1 (A) y el peso molecular (B).

Los compuestos antioxidantes son reductores o inhibidores de la oxidación. Las sustancias antioxidantes como reductores pueden reducir la forma oxidada de Fe3+ al ion Fe2+ reducido en el compuesto de ferricianuro. De este modo, el color amarillo del Fe3+ se transforma en numerosos tonos verdes y se forma el Fe2+ azul debido al poder reductor de las muestras antioxidantes. BMEPS mostró un efecto reductor débil de Fe3+, en comparación con los materiales de referencia (Fig. 3A). Mostró un poder reductor representado como absorbancia que comenzó en 0,200 ± 0,02 a 100 μg/ml y finalizó en 0,444 ± 0,03 a 1000 μg/ml, en comparación con el ácido ascórbico (0,392 ± 0,004 a 0,780 ± 0,003) o el BHT (0,287 ± 0,013 a 0,603 ± 0,03) a las mismas concentraciones. La CI50 del Fe3+ fue mayor que la del ácido ascórbico o el BHT; 1263,26, 237,13 y 518,05 μg/ml, respectivamente.

Efectos de la capacidad de reducción (A), quelación de metales (B) y supresión de la peroxidación lipídica (C) de BMEPS en diferentes concentraciones (100–1000 μg/ml), en comparación con los materiales de referencia LAA y BHT. (LAA: ácido L-Ascórbico y BHT: hidroxitolueno butilado). Los datos se presentaron como media ± SE. Se utilizó ANOVA unidireccional para el análisis de datos (n = 3, P ≤ 0,05). Los datos van seguidos de letras minúsculas; a significa diferencia significativa con ácido ascórbico, b significa diferencia significativa con BHT.

Ferrozine puede reaccionar con iones Fe2+ en el medio y formar complejos. Los materiales quelantes competirán con el Fe2+ para reaccionar con Ferrozine si están presentes en el medio de reacción. De este modo, el color rojo del complejo ferrozina-Fe2+ desapareció, lo que indica que se evitó la formación del complejo ya que el material quelante evaluado capturó Fe2+ antes que la ferrozina. Los cambios en la intensidad del color indican la coexistencia de agentes quelantes23.

BMEPS mostró una capacidad quelante de Fe+2 moderada, en comparación con los materiales de referencia (Fig. 3B). Previno la formación del complejo ferrozina-Fe+2 (29,2% 0 ± 1,51 a 54,04% ± 2,96 a 100 a 1000 μg/ml) en comparación con LAA (62,99% ± 1,01 a 98,19% ± 1,82) o BHT (52,41% ± 1,59 a 99,09% ± 0,90) a las mismas concentraciones. Se pudo concluir que la CI50 de BMEPS (827,46 μg/ml) fue mayor que los valores de CI50 de LAA o BHT; 26,36 y 68,88 μg/ml, respectivamente.

La peroxidación lipídica es un conjunto de reacciones en cadena que involucran radicales libres que pueden causar diversos daños a la salud. Los ácidos grasos insaturados son atacados por ROS e inician reacciones en cadena de peroxidación radical. Cuando el ácido linoleico se incuba con un iniciador (Fe2−/H2O2), se oxidará y formará hidroperóxidos. En el sistema de tiocianato, los radicales linoleato oxidan el ion ferroso para crear ion férrico, que luego se mide espectrofotométricamente. Los componentes antioxidantes restringieron la oxidación de los iones ferrosos, lo que impidió la formación de radicales linoleicos en el sistema24.

En cuanto a los materiales de referencia, BMEPS exhibió una potente capacidad de inhibición de la peroxidación lipídica. BMEPS bloqueó el 32,42% ± 1,46 de la oxidación del ácido linoleico en el medio de reacción en la concentración más baja (100 μg/ml) en comparación con LAA (64,73% ± 2,20) o BHT (60,31% ± 1,69) en la misma concentración. Elevar la concentración de BMEPS a 1000 µg/ml elevó la inhibición de la oxidación del ácido linoleico a 60,22% ± 1,78, en comparación con LAA (100% ± 0,0) o BHT (100% ± 0,0) en las mismas concentraciones (Fig. 3C). La concentración de BMEPS de 552,50 µg/ml puede inhibir la oxidación del 50% de las moléculas de ácido linoleico, mientras que los materiales de referencia LAA o BHT representaron 28,64 y 39,30 µg/ml, respectivamente.

El ensayo de eliminación DPPH• se sugirió por primera vez en la década de 1950, originalmente para descubrir donantes de H en materiales naturales. El radical DPPH•, un cromógeno de color violeta, es un radical libre estable. El ensayo DPPH• dependió de la reducción de DPPH• en alcohol mediante un antioxidante donador de hidrógeno y formó la forma no radical DPPH–H, difenilpicrihidrazina de color amarillo. BMEPS exhibió un potente efecto eliminador de DPPH• en comparación con los materiales de referencia. En la concentración más baja de BMEPS, DPPH• fue fuertemente eliminado (81,67% ± 1,70), en comparación con LAA (75,17% ± 1,30) o BHT (80,46% ± 2,52) en las mismas concentraciones (Fig. 4A). La elevación de la concentración de BMEPS a 1000 μg/ml aumentó de manera insignificante el porcentaje de eliminación de DPPH• a 85,37% ± 2,63 en comparación con LAA (100,00% ± 0,00) o BHT (98,32% ± 1,69).

Capacidad de eliminación de BMEPS; DPPH• (A) y ABTS + (B), superóxido (C) y NO (D) en diferentes concentraciones (100–1000 μg/ml), en comparación con materiales de referencia; LAA y BHT. (NO: radical óxido nítrico; LAA: ácido L-ascórbico; BHT: hidroxitolueno butilado; DPPH.: radical libre 1,1difenil-2-picril-hidracilo). Datos presentados como media ± SE. Se utilizó ANOVA unidireccional para el análisis de datos (n = 3, P <0,05). Los datos van seguidos de minúscula; a significa diferencia significativa con ácido ascórbico, b significa diferencia significativa con BHT.

En el ensayo de decoloración, la eficacia eliminadora de radicales de BMEPS se estimó utilizando el radical catiónico ABTS•+; esta eficacia se evaluó en comparación con dos materiales de referencia; LAA y BHT. El radical catión ABTS•+ se libera directamente antes de la reacción con los antioxidantes donadores de hidrógeno y produce el cromóforo ABTS•+ azul/verde. ABTS•+ puede neutralizarse mediante reducción directa mediante transferencias de electrones o mediante extinción de radicales mediante transferencia de átomos de hidrógeno25.

BMEPS mostró una potente capacidad de eliminación de cationes ABTS+ de una manera dependiente de la concentración (Fig. 4B). La concentración más baja (100 μg/ml) de BMEPS eliminó un porcentaje bajo de eliminación de ABTS+ (20,32 % ± 0,68) en comparación con LAA (66,32 % ± 2,68) o BHT (62,18 % ± 1,81). De acuerdo, aumentar la concentración a 1000 µg/ml eliminó más cantidad de radical catiónico ABTS+ (99,52% ± 0,51) en comparación con LAA (100,00% ± 0,00) o BHT (100,00% ± 0,00). Se registraron diferencias insignificantes entre BMEPS, LAA y BHT a 750 y 1000 µg/ml. La IC50 de los BMEP fue de 333,22 μg/ml mientras que LAA o BHT presentaron 18,61 y 33,44 μg/ml, respectivamente.

El superóxido (O2), gas oxígeno aniónico (O2), es la principal causa del estrés oxidativo. El O2·-se genera en sistemas de metosulfato de fenazina (PMS)-nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) mediante la oxidación de NADH y se analiza mediante la reducción de nitro azul tetrazolio (NBT). En este método, el O2 reduce el tinte amarillo NBT2+ para producir el formazán azul que se mide espectrofotométricamente a 560 nm. Generalmente, los antioxidantes pueden inhibir la formación de NBT azul. La disminución de la absorbancia indica el consumo de anión superóxido en la mezcla de reacción, lo que significa la presencia de material antioxidante.

BMEPS capturó radicales de O2 de manera dependiente de las concentraciones, en comparación con los materiales de referencia (Fig. 4C). En los medios de reacción que contenían BMEPS en concentraciones consecutivas (100—1000 µg/ml), se capturó del 68,45% ± 1,55 al 99,33% ± 0,67 de radicales O2, en comparación con LAA (66,21% ± 1,79 al 98,11% ± 2,25) y BHT (73,22). ± 2,78 a 98,11% ± 1,89) a las mismas concentraciones. La mayor concentración de BMEPS, LAA y BHT mostró que la capacidad de eliminación de O2 era casi igual. La concentración de BMEPS para inhibir el 50% de los radicales O2 generados fue de 19,96 µg/ml, en comparación con LAA y BHT; 22,35 y 20,551 µg/ml, respectivamente.

El óxido nítrico (NO) liberado por los SNP tiene un poderoso NO+ que puede cambiar la estructura y funcionalidad de numerosos componentes celulares. Cuando el NO interactúa con el superóxido para generar el anión peroxinitrito (. ONOO-), aumenta su toxicidad, que es un oxidante potencialmente poderoso que puede descomponerse para producir OH y NO226.

BMEPS ejerció una acción lánguida sobre el NO; Los porcentajes de eliminación fueron de 18,62% ± 0,61 a 38,32% ± 1,19 en concentraciones de 100 a 1000 μg/ml con respecto a LAA (64,39% ± 1,61 a 93,27% ± 2,73) o BHT (65,99% ± 2,00 y 95,88% ± 1,89). La IC50 de BMEPS fue de 2403,253 µg/ml en comparación con LAA y BHT (19,96 y 16,93 µg/ml, Fig. 4D).

La actividad antiinflamatoria de BMEPS se midió calculando el porcentaje de inhibición del H2O2 liberado por la oxidación de la leucodiclorofluoresceína (1-DCF) en presencia de fenol. Se examinó la eficacia antiinflamatoria de los polisacáridos en comparación con celecoxib como fármaco antiinflamatorio con más selectividad hacia la COX-2 que hacia la COX-1. El efecto represivo de los BMEP sobre la COX-1 fue menor que su efecto sobre la COX-2 (Fig. 5A). La COX-1 registró una ligera inhibición (6,21% ± 0,09 a 20,82% ± 1,00 con BMEPS (100—1000 μg/mL) en comparación con la inhibición con celecoxib; 2,36% ± 0,77 y 17,24% ± 1,51 a las mismas concentraciones. La IC50 de BMEPS (6367,38 μg/ml) fue mayor que el de celecoxib (3820,64 μg/ml), lo que significa que este polisacárido es más seguro que celecoxib en el sistema fisiológico.

Actividad de inhibición de la COX-1 (A) y la COX-2 (B) de diferentes concentraciones (100-1000 μg/mL) de BMEPS y Celecoxib. Datos presentados como media ± SE. Se utilizó ANOVA unidireccional para el análisis de datos (n = 3, p <0,05). Los datos van seguidos de una letra minúscula, media de diferencia significativa con celecoxib.

BMEPS suprimió la actividad de la COX-2 en aproximadamente 20,74% ± 1,00, 30,34% ± 1,52, 49,67% ± 1,63, 62,88% ± 1,85 y 78,09% ± 2,00 a 100, 250, 500, 750 y 1000 μg/ml, respectivamente. en comparación con celecoxib (Fig. 5B). Así, BMEPS a una concentración de 500,40 μg/mL puede inhibir el 50% de la COX-2, en comparación con celecoxib que representó 221,72 μg/mL.

BMEPS tuvo una acción inhibidora moderada de la AChE con concentraciones dependientes. BMEPS mostró porcentajes de inhibición de AChE que oscilaron entre 24,82% ± 0,88 y 60,15% ± 1,85 en concentraciones de 100 a 1000 ug/mL (Fig. 6A). Los 691,77 μg/mL es la concentración de BMEP que bloqueó el 50% de la actividad de la AChE. BMEPS exhibió una actividad de inhibición de BChE que oscilaba entre 39,78% ± 1,73 y 94,62% ​​± 2,66 en concentraciones que oscilaban entre 100 y 1000 µg/ml (Fig. 6B). En consecuencia, 288,27 µg/ml es la concentración que inhibe el 50% de una enzima (CI50 de BMEPS).

Efecto inhibidor de la colinesterasa de BMEPS en diferentes concentraciones (100-1000/ml), AChE (A) y BChE (B). Los datos se presentaron como media ± SE. Se utilizó ANOVA unidireccional para el análisis de datos (n = 3, P ≤ 0,05).

La tirosinasa es una oxidorreductasa que contiene cobre. Acelera el proceso de ortohidroxilación de monofenoles y oxidación aeróbica de catecol. La actividad de la enzima se midió espectrofotométricamente midiendo la oxidación de 3, 4-dihidroxifenilalanina (L. DOPA) al dopacromo rojo. La actividad antitirosinasa de las BMEP se determinó durante tres períodos de incubación (10, 20 y 40 minutos) y se comparó con el ácido kójico como inhibidor estándar. BMEPS mostró un potente carácter antitirosinasa en comparación con el ácido kójico, en concentración y acción dependiente del tiempo (Fig. 7). El efecto antitirosinasa de BMEPS aumentó al aumentar el tiempo de incubación. El porcentaje de inhibición de tirosinasa registrado por BMEPS osciló entre 5,18% ± 0,18 y 23,55% ± 0,56 en concentraciones de 100 a 1000 μg/ml después de 10 minutos de incubación en comparación con el ácido kójico de 9,34% ± 0,66 a 40,35% ± 1,65 en las mismas concentraciones. La eficacia de la inhibición aumentó al aumentar el tiempo para alcanzar la inhibición máxima después de una incubación durante 40 minutos; 29,64% ± 0,68 a 58,78% ± 1,85 en concentraciones de 100 a 1000 μg/ml, en comparación con el ácido kójico (70,32% ± 1,68 a 100% ± 0,0) en las mismas concentraciones. Los valores IC50 de BMEPS en todos los períodos de incubación (3,34, 14,00 y 22,96 μg/ml después de 10, 20 y 40 minutos) fueron menores que los del ácido kójico (6,00, 29,62 y 62,97 μg/ml) en las mismas duraciones, lo que significa que El polisacárido probado es más prometedor como inhibidor antitirosinasa que el ácido kójico.

Actividad de inhibición de la tirosinasa de diferentes concentraciones (100–1000 μg/ml) de BMEPS y materiales de referencia Ácido kójico. Datos presentados como media ± SE. Se utilizó ANOVA unidireccional para el análisis de datos (n = 3, P <0,05). Los datos van seguidos de minúscula; una diferencia significativa con el ácido kójico.

Las bacterias marinas de diferentes géneros son una fuente prometedora para la producción de varias sustancias bioactivas con diversos usos biotecnológicos. Muchos compuestos bacterianos conocidos como EPS tienen una amplia gama de aplicaciones y actividades fisiológicas destacadas, como cristalización, emulsificación y agentes antioxidantes27. Se evaluó la producción de Eps en cuatro aislados de bacterias marinas S4, S7, S13 y S16 y se encontró que el aislado S16 tiene un rendimiento de EPS y una eficacia inhibidora de la acetilcolinesterasa relativamente más altos. El aislado bacteriano prometedor (S16) pertenece a la subdivisión gamma del filo Proteobacteria y está estrechamente relacionado con Bacillus maritimus MSM1.

Se evaluó la composición química de BMEPS. La investigación de monosacáridos se realizó mediante HPLC y se comparó con estándares. BMEPS estaba formado por ácido manurónico, ácido glucurónico, glucosa y manosa en una proporción molar de 0,8:1,0:2,8:2,3, respectivamente. El análisis GPC estimó el peso molecular promedio (Mw) del BMEPS en 4,31 × 104 g/mol y el número molecular promedio (Mn) en 3,87 × 104 g/mol. La disparidad, que se define como la relación entre Mw y Mn, fue igual a 1,1. Las pentosas, hexosas o ácidos urónicos suelen estructurarse en unidades repetitivas y constituyen la mayoría de los EPS producidos por las bacterias marinas. Debido a que la ubicación en el intestino está determinada por la composición química, la composición de glucosa y manosa de los EPS crea una capa de agua sin mezclar en el intestino, lo que reduce la absorción de carbohidratos y lípidos. Por tanto, las fibras solubles son algo eficaces en el tratamiento de la diabetes, ya que pueden reducir el aumento posprandial del azúcar en sangre28. La mayoría de los EPS producidos por bacterias marinas tienen grupos OH- y COO-, que les dan una carga negativa temporal y características ácidas. La mayoría de los EPS marinos son generalmente lineales, tienen un rango de longitudes y una masa molecular media de 1 × 105 a 3 × 105 g/mol29. En los últimos años se ha informado que las bacterias hidrotermales de aguas profundas que secretan EPS tienen un alto peso molecular, hasta 1 × 106 g/mol, frecuentemente ácidas, e incluyen ácido urónico en una concentración de ~ 30%.

Un tipo específico de enfermedad cerebral es la enfermedad de Alzheimer. Se produce por un daño a las neuronas del cerebro, que son células nerviosas. Las neuronas del cerebro son necesarias para todas las actividades humanas, incluidas caminar, hablar y pensar. Las primeras neuronas que sufren daños en el Alzheimer son aquellas que se encuentran en regiones del cerebro involucradas en la memoria, el lenguaje y el pensamiento. Como resultado, los primeros síntomas suelen ser problemas de memoria, lenguaje y pensamiento. A pesar de que estos síntomas son novedosos para el individuo afectado, se cree que las alteraciones cerebrales que los provocan comenzaron 20 años o más antes de los síntomas30. El envejecimiento, la genética, las lesiones en la cabeza, las enfermedades vasculares, las infecciones y las variables ambientales como el estrés oxidativo, los metales pesados, los metales traza y la inflamación cerebral, entre otros, se han considerado factores de riesgo para la enfermedad de Alzheimer (EA). Actualmente se desconoce qué causa las alteraciones patológicas en la enfermedad de Alzheimer (A, NFT y pérdida sináptica). Se propusieron varias hipótesis como causa de la EA, pero se cree que dos de ellas son la causa principal: algunos creen que un deterioro de la función colinérgica es un factor de riesgo crítico para la EA, mientras que otros sugieren que la alteración en la producción de proteína β amiloide y El procesamiento es el principal factor iniciador. Sin embargo, en este momento no existe ninguna teoría ampliamente aceptada sobre la patogénesis de la EA31.

Se ha informado que alrededor de 24 millones de personas padecen la enfermedad de Alzheimer en todo el mundo hasta el momento, y para 2050, los expertos predicen que ese número se habrá cuadruplicado. Aunque la EA es un problema de salud pública, actualmente sólo hay dos tipos de medicamentos aprobados para tratar la EA: inhibidores de la enzima colinesterasa (análogos híbridos, sintéticos y de origen natural) y antagonistas del N-metil D-aspartato (NMDA)32. Investigaciones recientes han revelado que las sustancias naturales tienen un efecto neuroprotector y se han utilizado durante mucho tiempo como agentes terapéuticos para tratar una variedad de trastornos degenerativos. Se ha demostrado que las sustancias naturales ofrecen potencial terapéutico para la EA en estudios tanto in vitro como in vivo, lo que permite que algunas de ellas pasen a las etapas de ensayos clínicos. La primera sustancia natural que entró en ensayos clínicos para la EA fue la nicotina. Posteriormente, otras sustancias, como las vitaminas C, E y D, atrajeron cada vez más interés debido a sus efectos protectores contra la neuroinflamación y el daño oxidativo. Recientemente, se evaluó la briostatina, un extracto de lactona macrólida del briozoo Bugula neritina, y se demostró la capacidad de inducir la actividad de la α-secretasa, reducir la producción de Aβ y mejorar el aprendizaje y la memoria en un modelo de ratones con EA33. Otros compuestos naturales utilizados en la medicina popular (medicina tradicional china) han mostrado resultados prometedores en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer al actuar sobre varios mecanismos34.

En el presente estudio se evaluaron las capacidades antioxidantes de BMEPS de B. maritimus MSM1. En general, BMEPS mostró buenas características antioxidantes en: (i) radicales libres neutralizados (DPPH. y ABTS+), (ii) RS eliminados (O2− y NO), (iii) iones Fe+2 quelados y (iv) peroxidación lipídica inhibida, en comparación con dos materiales de referencia LAA y BHT. En consecuencia, las propiedades antioxidantes de los polisacáridos naturales han sido documentadas en varios estudios. Nuestro estudio fue respaldado por hallazgos de Ibrahim et al.14 sobre EPS de Adansonia digitate, El-Newary et al.6 EPS ácidos de B. amyloliquefaciens marino 3MS 2017, EPS ácidos producidos a partir de Bacillus sp. NRC57.

Las propiedades antioxidantes del BMEPS podrían discutirse dependiendo de su composición química. La actividad antioxidante de los polisacáridos naturales se ve afectada por varios factores, incluidas las características estructurales, el número de grupos activos (OH, COOH y SO4), el contenido de sulfato y la posición de unión, los enlaces de peso molecular y el peso molecular35. Las características antioxidantes de los polisacáridos (PS) actuales podrían explicarse dependiendo de muchos ejes de la siguiente manera: En el primer eje, el contenido de monosacáridos del PS se asocia con características antioxidantes, particularmente ramnosa y manosa36. El segundo eje, el tipo de enlaces glicosilo juega una función esencial en las propiedades antioxidantes, específicamente la arabinosa (1–4) y la manosa (1–2) de la cadena lateral que está fuertemente ligada a la capacidad reductora, mientras que la glucosa (1–6 ) y arabinosa (1– 4) están estrechamente correlacionados con la actividad eliminadora de radicales DPPH37. El tercer eje, los ácidos urónicos en PS ácidos los convierten en potentes agentes antioxidantes38 y los ácidos urónicos ejercieron una prometedora capacidad reductora y eliminadora de radicales libres en el siguiente orden; ácido poligalactourónico > ácido glucurónico > ácido galactourónico38. El cuarto eje, el peso molecular, tiene un fuerte efecto sobre las capacidades antioxidantes, donde el polisacárido de bajo peso molecular es superior a las moléculas con masas altas. El PS de bajo peso molecular tiene un potente poder reductor para neutralizar los radicales libres. Xing et al.39 demostraron que el quitosano que tiene un peso molecular bajo (9 kDa) exhibió una eficacia eliminadora de O2- mejor que el quitosano con un peso molecular alto (760 kDa). Además, los polisacáridos de arroz, con pesos moleculares bajos, tienen un poder reductor prometedor, quelación de metales y capacidades de eliminación de radicales libres. El quinto eje son los grupos funcionales adjuntos, los polisacáridos sulfatados de bajo peso molecular, como los polisacáridos de Ulva pertusa, tienen mejores capacidades antioxidantes que el polisacárido sulfatado con alto peso molecular PS40. Finalmente, los grupos sulfato aumentaron la capacidad de los polisacáridos sulfatados como captadores de radicales libres, quelantes de metales e inhibición de la formación de peroxidación lipídica38. Los polisacáridos con alto contenido de sulfato fueron más efectivos que los bajos41. La eliminación de radicales libres de materiales se realiza mediante transferencia de electrones o donación de hidrógeno de los materiales antioxidantes a este radical para que tenga una forma estable24. El PS puede donar átomos de hidrógeno porque los enlaces de hidrógeno tienen bajas energías de disociación. Los enlaces de hidrógeno de los polisacáridos son débiles debido a la posición del azufre en los polisacáridos sulfatados. Además, los grupos sulfato del PS sulfatado atraparon radicales libres electrostáticamente42. El sexto eje es el pH, las capacidades antioxidantes de los polisacáridos ácidos de bajo peso molecular son mejores que las de los polisacáridos ácidos de alto peso molecular43. De acuerdo con la relación estructura-actividad mencionada anteriormente, se podría sugerir que las propiedades antioxidantes del BMEPS podrían estar asociadas con su bajo peso molecular (4,31 × 104 g/mol), ácidos urónicos (24,7%), sulfato (18,3%), composición de monosacáridos; ácido manurónico, ácido glucurónico, glucosa y manosa en una relación molar de 0,8:1,0:2,8:2,3, respectivamente.

Este estudio demostró la capacidad antiinflamatoria selectiva de BMEPS contra la COX-2 en comparación con la COX-1. Los resultados obtenidos estuvieron en línea con Ibrahim et al.14 sobre el polisacárido digitado de Adansonia, El-Newary et al.6 sobre EPS ácido obtenido de B. amyloliquefaciens 3MS 2017, y Mohamed et al.7 sobre EPS ácido de Bacillus sp NRC5.

Los principales factores de la reacción inflamatoria podrían resumirse en los siguientes (i) síntesis de óxido nítrico (NO) y prostaglandinas, (ii) expresión de NF kappa B, (iii) especies reactivas de oxígeno (ROS), (iv) migración de leucocitos y finalmente (v) las citocinas proinflamatorias, es decir, TNF, IL6 e IL144. El efecto antiinflamatorio de BMEPS, si se prueba en un modelo in vivo, podría mencionarse a través de su efecto sobre el estrés oxidativo, en particular la capacidad de eliminación de NO y ROS, que se registró en este estudio. En el estudio actual, BMEPS mostró una buena eliminación de radicales libres; NRS y ROS, quelación de metales, poder reductor y eficacia de inhibición de la peroxidación lipídica. BMEPS redujo significativamente la concentración de NO, lo que a su vez reduce y controla la progresión de la inflamación in vivo. Además, BMEPS neutraliza considerablemente los radicales superóxido, lo que a su vez reduce la toxicidad del NO.

Además, BMEPS mostró actividad anticolinesterasa contra AChE o BChE. Varios polisacáridos tienen acción inhibidora de la AChE. Por ejemplo, el proteoglucano (PGM) de hongos45, los EPS de L. delbrueckii subsp. bulgaricus B3 y L. plantarum GD246, EPS producidos a partir de la macroalga parda Ecklonia radiata47. De acuerdo, Park et al.48 demostraron que el polisacárido sulfatado producido a partir de Ecklonia cava exhibía efectos supresores competitivos y no competitivos sobre la acetilcolinesterasa en células PC12 inducidas por H2O2. Además, los polisacáridos sulfatados producidos a partir de algas marinas como E. maxima, G. pristoides, U. lactuca, U. rigida y G. gracilis redujeron significativamente la actividad de la acetilcolinesterasa en las células tratadas con Zn (50 μM) solo49,50. .

Por otro lado, la AChE se ve significativamente afectada por la toxicidad de metales como Ze y Cu. En un experimento con peces Leporinus obtusidens (piava), la exposición al zinc y al cobre activó significativamente la AChE51. Además, la exposición del pez cebra a niveles superiores a 1 ppm de ZnCl2 produjo un síndrome similar a la enfermedad de Alzheimer (EA), que incluye supresión de la ACh, disminución del comportamiento locomotor y deterioro de la memoria a corto plazo debido a la activación de la AChE. Además, el ZnCl2 induce niveles de β-amiloide y proteína Tau fosforilada en el cerebro52. Por lo tanto, capturar el exceso de estos metales del medio podría inhibir la AChE y aumentar el contenido de ACh en el área sináptica. En este estudio, BMEPS exhibió capacidad quelante de metales, lo que podría ser la razón por la que es anticolinérgico en aplicaciones in vivo. Por otro lado, los compuestos sulfatados pueden reaccionar con el sitio aniónico de la AChE y reducir su actividad48, lo que significa que el polisacárido sulfatado utilizado en este estudio puede mostrar en parte su acción inhibidora sobre la AChE de esta manera.

El otro mecanismo que se examinó en este estudio es la vía de la tirosinasa. Existen muchos inhibidores de la tirosinasa, tanto de fuentes sintéticas como naturales. Los mecanismos de inhibición de la tirosinasa incluyen uno o más de los siguientes; (i) reducción de dopaquinona como el ácido ascórbico, (ii) eliminación de o-dopaquinona como en compuestos que contienen tio53, (iii) quelación de cobre que puede regular la actividad de la tirosinasa debido a la estructura de cobre de la tirosinasa como ácido kójico54 y (iv) materiales eliminadores de H2O2 , donde el H2O2 activó la tirosinasa y sirvió como segundo sustrato55. De acuerdo con la explicación presentada anteriormente, podríamos concluir que la actividad antitirosinasa del BMEPS está relacionada con ser un quelante de metales, captador de H2O2 y su contenido en grupos sulfatados.

En conclusión, el exopolisacárido marino producido a partir de Bacillus maritimus MSM1 se caracterizó mediante análisis fisicoquímicos mediante análisis UV, FTIR, HPLC y GPC. Estos análisis demostraron que es un polisacárido sulfatado de bajo peso molecular con sustitución urónica (24,7% y 18,3%, respectivamente) y los monosacáridos se presentan en relación molar 0,8:1,0:2,8:2,3 para ácido manurónico, ácido glucurónico, glucosa y manosa. , respectivamente, con la abundancia de configuraciones β. El GPC estimó el peso molecular promedio (Mw) en 4,31 × 104 g/mol. BMEPS exhibió caracteres antioxidantes prometedores y una acción inhibidora selectiva contra la COX-2. Las eficacias probadas respaldan la incorporación de este polisacárido como un fármaco alternativo prometedor en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y relacionadas con el estrés oxidativo. Además, BMEPS muestra actividades anticolinesterasa y antitirosinasa que son relevantes para las enfermedades neurodegenerativas. Las características biológicas prometedoras de BMEPS pueden atribuirse a su riqueza en grupos SO3 y COO, enlace β-glucosídico y su bajo peso molecular. Del estudio se desprende claramente que BMEPS puede ser candidato en estudios médicos más avanzados como nueva materia prima natural para medicamentos para el tratamiento del Alzheimer.

1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH), peroxidasa, H2O2, ABTS (ácido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico), monolaurato de polioxietilensorbitán (Tween-20), ascórbico ácido (vitamina C), hidroxitolueno butilado (BHT), dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH), sal de nitroazul de tetrazolio (NBT), metosulfato de fenazina (PMS), nitroprusiato de sodio (SNP), sulfanilamida, orto-H3PO4, diclorhidrato de naftiletilendiamina, sal de diamonio , 3-(2-piridil)-5,6-bis (ácido 4-fenil-sulfónico)-1,2,4-triazina (ferrozina), cloruro ferroso, ácido tricloroacético (TCA), ferricianuro de potasio, Leuco-2, Diacetato de 7-diclorofluorescente, hematina, ácido araquidónico, enzimas ciclooxigenasas (COX-1 de oveja, EC. 1.14.99.1 para COX-2), enzima acetilcolina esterasa, yoduro de acetiltiocolina, DTNB, yoduro de butiriltiocolina, enzima butirilcolinesterasa, ácido kójico , enzima tirosinasa y L-Dopa se adquirieron en Sigma-Aldrich, EE. UU.. El tiocianato de amonio se adquirió en E. Merck. Todos los productos químicos y disolventes son de calidad analítica.

Se recolectaron tres muestras de sedimentos marinos en diferentes lugares de Sahl Hashish, Mar Rojo de Hurghada, Egipto.

Las muestras recolectadas (10 g) se colocaron en 100 ml de agua de mar estéril y se homogeneizaron mediante agitación a 200 rpm durante 20 min y se realizó una dilución seriada56. Finalmente, se inocularon 50 μL del sobrenadante de cada dilución en agar nutritivo marino y las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h. Las colonias que aparecieron por placa de cada muestra fueron sometidas a purificación. La producción de EPS se demostró mediante la formación de una colonia mucosa, seguida de la precipitación de EPS a base de alcohol. Los cultivos frescos de aislados marinos se aplicaron a medio agar sólido (g/L): glucosa 20, CaCO3 0,1, NH4NO3 0,8, K2HPO4 0,6, KH2PO4 0,05, MnSO4.4H2O 0,1, extracto de levadura 1,0 y agar 15, y se incubaron por separado a 37ºC. Se examinó la formación de colonias mucosas observando la presencia de colonias mucosas viscosas en la placa durante 3 días. Además, las colonias con bucles se sumergieron en alcohol para observar la precipitación de EPS. Cuando se mezcla un asa de cultivo con etanol absoluto previamente enfriado, las colonias precipitan de la solución, lo que confirma el productor de EPS.

Se seleccionaron aislados para la producción de EPS en un medio MY modificado con 75% de agua de mar. El medio está compuesto por (g/L): peptona 4,0, extracto de levadura 2,0 y sacarosa 20,0, pH 757. El medio se distribuyó en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, que contenía 50 ml de volumen de trabajo. Los matraces se esterilizaron en autoclave e inocularon utilizando un cultivo en crecimiento activo y se incubaron a 37 °C durante 3 días. El caldo fermentado se recogió y se centrifugó a 5000 rpm a 4 °C durante 30 minutos en Sigma-Laborzentrifugen, 2K15, para eliminar las células bacterianas. Se añadió TCA (5%) y se dejó durante la noche a 4 °C, luego se centrifugó a 5000 rpm para eliminar la proteína58. El pH de la solución transparente se ajustó a 7,0 con NaOH 0,1 M y el EPS bruto se precipitó mediante la adición de 4 volúmenes de etanol absoluto previamente enfriado al líquido sobrenadante; éste se almacenó durante la noche a 4ºC. Luego se centrifugó la muestra y, después de decantar la solución de etanol, el sedimento recuperado se volvió a disolver en agua desionizada. El EPS crudo disuelto se sometió a otra etapa de precipitación con etanol absoluto preenfriado, seguido de una posterior centrifugación y decantación de etanol como se describió anteriormente. Luego, el sedimento obtenido se volvió a disolver en un mínimo de agua desionizada y se dializó tres veces (1000 ml x 3) contra agua corriente del grifo utilizando un tubo de diálisis (corte MWCO 3500 Da) durante 24 h. La solución dializada se sometió a precipitación fraccionada con 1, 2, 3 y 4 volúmenes de etanol absoluto preenfriado. La fracción de rendimiento mayoritaria obtenida con 1 volumen de etanol absoluto se secó al vacío a 40 °C59. El espectro de absorción UV se registró utilizando un espectrofotómetro UV-Vis (2401PC Shimadzu, Japón) entre 200 y 800 nm, para examinar la existencia de proteínas y ácidos nucleicos3. La fracción principal de EPS de 1 volumen de etanol (BMEPS) se analizó in vitro frente a la inhibición de la acetilcolinesterasa.

El aislado prometedor (S16), que produjo altas cantidades de EPS e inhibidor de la acetilcolina esterasa, se identificó con base en las características bioquímicas, morfológicas y fisiológicas del productor potencial determinadas mediante la adopción de métodos estándar60,61 La cepa se confirmó con el aislamiento ribosómico 16S. Secuencia del gen de ARN y se compara con otras secuencias bacterianas mediante NCBI BLAST. La afiliación taxonómica de las secuencias se recuperó del programa clasificador del proyecto de base de datos ribosomal62,63.

El ADN genómico de los aislados se extrajo utilizando el kit de extracción de ADN genómico bacteriano. El proceso de amplificación tomó 2:35 en total. En un gel de agarosa al 0,8% teñido con un tinte seguro para ADN, se observaron los productos de la PCR. Finalmente, se secuenciaron los productos de la PCR y los datos de secuencia obtenidos se analizaron utilizando el software de la herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) frente a la base de datos de secuencias de ARN ribosómico 16S. , con el software mega X (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mahalik) para generar el árbol filogenético del centro nacional de biotecnología.

El fragmento del gen 16S rRNA se comparó con la base de datos de nucleótidos NCBI utilizando Blastn. El siguiente ADNr 16S bacteriano de homólogos taxonómicamente caracterizados se recopiló de la base de datos Genbank en NCBI (//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) y se utilizó para el análisis filogenético.

Se sometió BMEPS (50 mg) a hidrólisis con HCl 6 N durante 4 h a 100 °C en un tubo sellado. En un baño de agua a 40 °C, se eliminó el HCl y (1 ml x 3) se codestiló con agua64. Los ácidos urónicos se estimaron a 525 nm utilizando el procedimiento de m-hidroxibifenilo. El sulfato en el hidrolizado se evaluó según el método Dodgson65. Los monoazúcares hidrolizados se analizaron mediante el modelo HPLC Agilent serie 1100 (Agilent EE. UU.)6.

La espectroscopia UV-Vis se realizó en el espectrofotómetro UV-Vis 2401PC Shimadzu, Japón, en el rango de longitud de onda de 190 a 700 nm. El FTIR se midió en el rango de 400 a 4000 cm-1 en un espectrofotómetro Bucker14 Vector 22.

El peso molecular promedio en peso (Mw) del BMEPS se midió mediante cromatografía de permeación en gel de alta resolución (HP-GPC) utilizando el sistema Agilent HPLC1100 de la serie según You et al.55.

El poder reductor de Fe3+ de BMEPS se analizó según el método de Oyaizu66 y se comparó con BHT y ácido ascórbico como materiales de referencia. Concentraciones sucesivas de polisacáridos y materiales estándar; Se prepararon hidroxitolueno butilado (BHT) y ácido ascórbico (LAA) en cantidades de 100, 250, 500, 750 y 1000 µg/ml en metanol. La actividad expresada como IC50 se calculó mediante análisis log-probit.

La actividad quelante Fe2+ de BMEPS se estimó según el método de Dinis et al.67 y se evaluó comparándola con dos compuestos estándar (BHT y ácido ascórbico en las mismas condiciones). El porcentaje de inhibición de la formación del complejo ferrozina-Fe2+ viene dado por la fórmula:

donde A0 fue la absorbancia del control y A1 fue la absorbancia en presencia de la muestra de polisacárido y estándares.

Según el método de Yamaguchi et al.23, la actividad eliminadora de radicales libres de BMEPS se determinó utilizando 1,1-difenil-2-picril-hidrazil (DPPH•). Según la siguiente ecuación, se calculó la actividad eliminadora de radicales DPPH:

donde A0 fue la absorbancia del control y A1 fue la absorbancia en presencia de MBES.

Con base en el método descrito por Miller y Rice-Evans68, y la modificación de Arnao et al.69, se estimó la actividad eliminadora de cationes radicales ABTS de BMEPS. La actividad eliminadora de cationes radicales ABTS se calculó de la siguiente manera:

La capacidad de BMEPS para inhibir la peroxidación lipídica se determinó según el método de Gülçin et al.70. La inhibición de la peroxidación lipídica en porcentaje se calculó mediante la siguiente ecuación:

donde A1, A2, A3 y A4 fueron la absorbancia de la muestra el día 1, 2, 3 y 4.

La medición de la actividad eliminadora del anión superóxido (O2-) de BMEPS se basó en el método descrito por Liu et al.71. La eliminación de O2− se calculó utilizando la siguiente fórmula:

donde A0 fue la absorbancia del control y A1 fue la absorbancia de polisacárido o muestras estándar.

Utilizando nitroprusiato de sodio (SNP), se determinó la actividad eliminadora de radicales NO del BMEPS. NO• generado a partir de SNP en una solución acuosa a pH fisiológico para producir iones nitrito que se midieron con el reactivo de Greiss72.

La actividad de inhibición de la ciclooxigenasa de BMEPS se realizó según Larsen et al.73 y se utilizó Celecoxib como compuesto estándar.

Evaluación inhibidora de la acetilcolinesterasa (AchE) y la butirilcolinesterasa (BChE).

La actividad enzimática de BMEPS se analizó mediante el método de Ingkaninan74. El porcentaje de inhibición se calculó mediante la fórmula:

El ensayo de inhibición de tirosinasa de BMEPS se realizó según los métodos de Liu et al.75. La capacidad antitirosinasa de BMEPS se comparó con la del ácido kójico (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.). El porcentaje de inhibición de tirosinasa se calculó de la siguiente manera:

Los datos se presentaron como mediana ± SE. Los datos de antioxidantes in vitro se analizaron mediante la prueba t en ANOVA unidireccional (n = 3 réplicas) utilizando el software MIB-SPSS, 25.0. El valor de P fue inferior a 0,05.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Este proyecto fue respaldado por el Centro Nacional de Investigación de Egipto, a través del Proyecto No. 11010319 (2016-2019) titulado “Producto natural para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer; Enfoque alternativo".

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Autoridad de Financiamiento de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF) en cooperación con el Banco Egipcio de Conocimiento (EKB). El estudio actual fue apoyado financieramente por el Centro Nacional de Investigación de Egipto, a través del Proyecto no. 11010319 (2016-2019), titulada “Productos naturales para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer; Enfoque alternativo". No se recibió ningún otro financiamiento de ninguna otra parte que pueda afectar los resultados, ya sea directa o indirectamente.

Departamento de Biotecnología Microbiana, Instituto de Investigación Biotecnológica, Centro Nacional de Investigación, Giza, 12622, Egipto

Manal S. Selim, Sahar S. Mohamed, Mohsen S. Asker y Mohamed E. El Awady

Departamento de Investigación de Plantas Medicinales y Aromáticas, Instituto de Investigación de las Industrias Farmacéuticas y Farmacéuticas, Centro Nacional de Investigación, Giza, 12622, Egipto

Abeer Y. Ibrahim & Samah A. El-Newary

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MSS, SSM, MSA y MEE produjeron exopolisacáridos y realizaron su caracterización, escribieron estos datos y revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final. AYI concibió y supervisó principalmente el trabajo y revisó el manuscrito. SAE y AYI realizaron biomarcadores antioxidantes, antiinflamatorios y anti-Alzheimer. AYI y SAE analizaron estos datos, escribieron y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Mohamed E. El Awady.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Selim, MS, Mohamed, SS, Asker, MS et al. Caracterización y propiedades de Alzheimer in vitro del exopolisacárido de Bacillus maritimus MSM1. Representante científico 13, 11399 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38172-z

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Recibido: 26 de marzo de 2023

Aceptado: 04 de julio de 2023

Publicado: 14 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38172-z

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